>1. Tag 9 (morgens): Starten Sie die Kultur für die enzymatische Messung.
- Resuspendieren Sie die Kultur und übertragen Sie 125 μl mit einer Mehrkanalpipette auf eine Spektralphotometerplatte (Messung OD600).
Anmerkung: Achtung: Geben Sie nicht den letzten Tropfen ab, um Blasen zu vermeiden, wenn der OD600 unter 0,3 - 0,6 liegt, inkubieren Sie die restlichen Zellen je nach Messwert noch 1 - 2 h länger. Die in diesem Schritt verwendete 125-μl-Kultur kann nach Ermessen des Benutzers verworfen oder zurück in den ursprünglichen Deep-Well-Block übertragen werden.
- Die restlichen Zellen im Deep-Well-Block werden 10 min bei 3000 x g und 21 °C zentrifugiert. Der Überstand wird durch Invertieren entfernt.
- 200 μl Z-Puffer zugeben und vortexen.
Anmerkung: Bitte beachten Sie das Rezept für Z-Puffer in Tabelle 1.
- 5 min bei 3000 x g und 21 °C zentrifugieren. Überstand durch Invertieren entfernen.
- 20 μl Z-Puffer zugeben und vortexen.
- Decken Sie die Platte mit Siegelfolie ab, die Frost-Tau-Zyklen standhält. Führen Sie 4 Gefrier-/Auftauzyklen mit flüssigem Stickstoff in einem Abzug und dann 42 ºC in einem Wasserbad durch (jeweils 2 Minuten).
- Fügen Sie 200 μl Z-Puffer/Beta-Mercaptoethanol (β-ME)/Ortho-Nitrophenyl-β-galactosid (ONPG) hinzu (12 mL, 21 μL, 8,4 mg ergeben jeweils 20 mL Lösung; immer frisch zubereiten).
Anmerkung: Es wird einige Zeit dauern, bis sich ONPG richtig aufgelöst hat, also bereiten Sie die Lösung eine Stunde vor diesem Schritt vor. ONPG dient als Substrat für die Messung der β-Galactosidase-Aktivität.
- Inkubieren Sie bis zu 17 - 24 h bei 30 °C (zwischendurch prüfen, wenn sich die Farbe früher entwickelt, fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort).
>2. Tag 10 (morgens): Stoppe die Reaktion und messe.
- Fügen Sie 110 μL 1MNa 2CO3 hinzu, um die Reaktion zu stoppen und die Zeit aufzuzeichnen.
- Vortex und zentrifugieren für 10 min bei 3000 x g und 21 °C.
- Nehmen Sie 125 μl Überstand mit Mehrkanal und messen Sie OD420,
Anmerkung: Achtung, geben Sie nicht den letzten Tropfen ab, um Blasen zu vermeiden.
Tabelle 1: Das Rezept für die im Protokoll verwendeten Lösungen. Die Tabelle enthält das Rezept für den Stamm und die Arbeitslösungen der wichtigsten Puffer, die im Assay verwendet werden.
| TE Puffer 10X (10ml) | |
| wünschenswert | Ab Lager |
| 1000mM Tris-Cl (pH 8,0) | 1 ml Tris 1 M |
| 10 mM EDTA (pH 8,0) | 200 μl EDTA 0,5 M |
| Füllen Sie das Volumen mit Wasser auf | |
| TE/LiAc (10ml) | |
| wünschenswert | Ab Lager |
| 1-mal | 1mL TE 10X |
| 0,1 Mio. LiAc | 1 mL LiAc 1 M |
| Füllen Sie das Volumen mit Wasser auf | |
| TE/LiAc/PEG (50 mL) 50% | |
| wünschenswert | Ab Lager |
| 1-mal | 5 mL TE 10X |
| 0,1 Mio. LiAc | 5 mL LiAc 1M |
| 40 ml PEG3350 | |
| Z-Puffer (1L) pH 7,0 | |
| Na2HPO4 16,1 g heptahydratisiert oder 8,52 g wasserfrei |
| NaH2PO4 5,5 g hydratisiert oder 4 g wasserfrei |
| KCl 0,75g |
| MgSO4 0,246 g hydratisiert oder 0,12 g wasserfrei |
| Aufrechterhaltung des pH-Werts mit HCl |
| Alle Lösungen werden vor der Verwendung sterlisiert. |
| Im Protokoll verwendete Medien und Agarplatten (YPDA, SD-Ura; SD-Trp-Ura und SD-Trp-Ura Agarplatten) folgen dem gleichen Rezept wie in Y1H |
