Messung der Helikase-Aktivität eines Zielproteins mit Hilfe von Biotin-markierten RNA-Duplexen

Zusammenfassung

Quelle: Yu, L. et al., In-vitro-Biochemische Assays mit Biotin-Markierungen zur Untersuchung von Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen. J. Vis. Exp. (2019)

In diesem Video demonstrieren wir das Verfahren zur Bestimmung der Helikase-Aktivität eines Zielproteins, um das Biotin-markierte dsRNA-Substrat abzuwickeln. Die Aktivität des Enzyms wurde durch die Analyse der elektrophoretischen Mobilitätsverschiebung identifiziert, gefolgt von einem Chemilumineszenz-Assay mit chemilumineszierendem Enzym-konjugiertem Streptavidin.

Protokoll

>1. Protein-Zubereitung

1. MOV10-Ausdruckskonstrukte
   1. Generieren von cDNA-Expressionskonstrukten, die für Maus MOV10 kodieren.
      1. Richten Sie die Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-Reaktionen für jedes Fragment ein. Mischen Sie 1 μl Maus-cDNA (aus C57BL/6 Maushoden), 1 μl dNTP, 2 μl 10 μM Forward-Primer, 2 μl 10 μM Reverse-Primer, 1 μl DNA-Polymerase, 25 μl 2x PCR-Puffer und 18 μl doppelt destilliertes H₂O (ddH₂O) in einem Endvolumen von 50 μl.
         Anmerkung: Die Primer für die Amplifikation von Mov10-Genfragmenten sind in Tabelle 1 aufgeführt.
      2. PCR-Reaktionen werden mit den folgenden Programmen durchgeführt: 95 °C für 5 Minuten, 35 Erhitzungszyklen bei 95 °C für 15 s, Glühen bei 64 °C für 15 s, Verlängerung bei 72 °C für 20 s (2 min für die Verlängerung des MOV10 in voller Länge) und abschließende Verlängerung bei 68 °C für 7 Minuten.
   2. Analysieren Sie die amplifizierte PCR-DNA mittels Gelelektrophorese, schneiden Sie die Bande der erforderlichen Größe schnell unter einer UV-Lampe aus dem Gel ab und legen Sie sie in ein Zentrifugenröhrchen.
      Anmerkung: Die erwartete Produktgröße, die auf dem Agarosegel für MOV10 sichtbar ist, beträgt 3015 bp.
   3. Aufreinigen Sie die PCR-DNA mit einem Gel-Extraktionskit gemäß dem Protokoll des Herstellers.
      1. Geben Sie ein gleiches Volumen an auflösendem Puffer in das Zentrifugenröhrchen aus Schritt 1.1.2 und schmelzen Sie das Gel in einem 50-55 °C Wasserbad für 5-10 min, wobei Sie darauf achten, dass die Gelstücke vollständig schmelzen. Kurz zentrifugieren, um eventuelle Tröpfchen von der Wand des Röhrchens aufzufangen.
         Anmerkung: Die Massen-/Volumenkonzentration des Gels und des auflösenden Puffers beträgt 1 mg/μL.
      2. Legen Sie die Adsorptionssäule in das Sammelröhrchen, überführen Sie die Lösung mit dem gelösten Gelfragment in die Adsorptionssäule und zentrifugieren Sie sie 2 Minuten lang bei 12.000 x g.
      3. Entsorgen Sie das Filtrat am Boden der Sammelröhrchen. Geben Sie 600 μl des Waschpuffers in die Säule, zentrifugieren Sie 1 Minute lang bei 12.000 x g und verwerfen Sie das Filtrat.
      4. Wiederholen Sie Schritt 1.1.3.3 einmal.
      5. Setzen Sie die Säule wieder in das Auffangröhrchen ein und zentrifugieren Sie sie 2 Minuten lang bei 12.000 x g, um den restlichen Waschpuffer zu entfernen.
      6. Legen Sie die Adsorptionssäule in ein sterilisiertes 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen, geben Sie 50 μl ddH₂O in die Mitte der Adsorptionssäule und zentrifugieren Sie 1 Minute lang bei 12.000 x g. Messen Sie die DNA-Konzentration des Eluats mit einem Spektralphotometer.
   4. Restriktionsverdau von Plasmiden
      1. Der pRK5-Vektor wird mit BamHI und XhoI verdaut, indem 4 μg pRK5-Vektor, 5 μl 10x Digest-Puffer, 1 μl BamHI und 1 μl XhoI und ddH₂O zu einem endgültigen Reaktionsvolumen von 50 μl gemischt werden. 2 h bei 37 °C inkubieren.
   5. Analysieren Sie die Vektor-DNA mittels Gelelektrophorese, schneiden Sie schnell mit einem Skalpell unter einer UV-Lampe das gewünschte Größenband aus dem Gel ab und legen Sie es in ein Zentrifugenröhrchen.
   6. Die Vektor-DNA mit einem Gel-Extraktionskit gemäß 1.1.3 gemäß den Anweisungen des Herstellers aufreinigen.
   7. Richten Sie eine rekombinante Standardligationsreaktion ein, indem Sie 0,03 pmol linearisierten Vektor, 0,06 pmol cDNA-Fragment, 2 μl Ligase und 4 μl 5x Ligasepuffer und ddH₂O in einem endgültigen Reaktionsvolumen von 10 μl.
      Anmerkung: Klonen Sie MOV10 in einen pRK5-Vektor.
   8. Die Mischung 30 min lang bei 37 °C inkubieren und dann die Reaktion sofort 5 min auf Eis abkühlen lassen. Umwandlung von rekombinanten MOV10-Plasmiden in DH5α-Bakterien.
      Anmerkung: Verifizieren Sie alle rekombinanten Konstrukte durch Sanger-Sequenzierung.
   9. Bereiten Sie Glycerinbestände von Bakterienkulturen vor, die verifizierte rekombinante Plasmide enthalten, indem Sie Flüssigkulturen ein gleiches Volumen von 50 % Glycerin zusetzen und bei -80 °C lagern.
      Anmerkung: Für jedes weitere Experiment werden Bakterien aus den Glycerinvorräten auf eine frische Agarplatte ausgestreckt und eine einzelne Kolonie für die Expansion verwendet, wie in Schritt 1.2 beschrieben.
2. MOV10-Proteinextrakte aus HEK293T Zellen
   1. Exprimieren Sie die MOV10-Proteine vorübergehend in kultivierten HEK293T Zellen.
      1. Bereiten Sie das MOV10-pRK5-Plasmid in einer Konzentration >500 ng/μl vor.
      2. Säen Sie HEK293T Zellen in 15 cm Schalen aus. Wenn die Zelldichte ~70%-90% erreicht, ersetzen Sie das Zellkulturmedium durch frisches Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), das 10% fötales Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin-Streptomycin enthält.
      3. Für eine Transfektion verdünnen Sie 60 μg MOV10-pRK5-Plasmid-DNA in 3 ml des reduzierten Serummediums, fügen Sie dann 120 μl des Transfektionsverstärker-Reagenzes hinzu und mischen Sie gut.
      4. In einem separaten Röhrchen 90 μl des Transfektionsreagenzes mit 3 ml reduziertem Serummedium (ohne Penicillin-Streptomycin) verdünnen und gut mischen.
      5. Geben Sie die verdünnte DNA in jedes Röhrchen mit verdünntem Transfektionsreagenz. 15 min bei Raumtemperatur inkubieren.
      6. Geben Sie die Transfektionsmischung in die Zellkultur und kultivieren Sie die Zellen für ~36-48 h.
   2. Nach 36-48 h entnehmen Sie Zellen von jeder Platte in einem 50-ml-Röhrchen. Zentrifugieren Sie 5 min lang bei 4 °C bei 500 x g. Waschen Sie jedes Pellet mit 10 mL eiskaltem PBS und sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 500 x g für 5 min bei 4 °C.
   3. Resuspendieren Sie das Pellet in 3 ml Zelllysepuffer, der einen vollständigen Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)-freien Proteasehemmer-Cocktail enthält. 30 min auf Eis inkubieren. Zentrifugieren Sie das Lysat bei 20.000 x g und 4 °C für 20 min.
   4. Geben Sie 100 μl magnetische Anti-FLAG-Kügelchen pro Zellschale in ein 1,5-ml-Röhrchen.
   5. Waschen Sie die magnetischen Kügelchen 2x mit K150 Puffer (50 mM HEPES bei pH 7,5, 150 mM KoAc, 1 mM DTT, 0,1% NP-40).
      1. Resuspendieren Sie die magnetischen Kügelchen in 1 mL eiskaltem K150-Puffer
      .
      2. Inkubieren Sie die magnetischen Kügelchen für 2 min bei 4 °C mit sanfter Drehung und pelletieren Sie die magnetischen Kügelchen mit Hilfe eines Magneten. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand.
   6. Geben Sie die magnetischen Kügelchen in den Zelllysatüberstand aus Schritt 1.3.3 und inkubieren Sie 2 h lang bei 4 °C.
   7. Waschen Sie die proteingebundenen magnetischen Kügelchen 3x mit K150 Puffer, dann 2x mit K150 mit 250 mM NaCl, dann 3x mit K150 Puffer als 1.3.5.
   8. Resuspendieren Sie die Kügelchen in 300 μl FLAG-Elutionspuffer (100 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl bei pH 7,5, 5 mM MgCl₂, 10% Glycerin), fügen Sie das FLAG-Peptid bis zu einer Endkonzentration von 0,5 μg/μl hinzu und inkubieren Sie mit Kügelchen auf einem Rotator bei 4 °C für 1 h, dann pelletieren Sie die magnetischen Kügelchen mit Hilfe eines Magneten.
   9. Sammeln Sie den Überstand, der die eluierten MOV10-Proteine enthält, bestimmen Sie die Konzentration und lagern Sie ihn für die zukünftige Verwendung bei -80 °C.

>2. Nukleinsäure-Vorbereitung

1. Kaufen Sie DNA- und RNA-Oligonukleotide (Oligos) mit oder ohne Biotinmarkierungen von einer geeigneten Quelle. Jedes Oligo wird in RNase-freiem ddH₂O auf 20 μM verdünnt und für die zukünftige Verwendung bei -80 °C aufbewahrt.
   Anmerkung: Die in dieser Studie verwendeten Oligosequenzen von DNA/RNA-Substraten sind in Tabelle 2 aufgeführt.
2. Bereiten Sie die folgende Mischung für die Annealing-Reaktion der doppelsträngigen RNA (dsRNA) für den MOV10-Helikase-Aktivitätsassay vor: Mischen Sie 60 mM N-2-Hydroxyethylpiperazin-N-ethan-sulfonsäure (HEPES) bei pH 7,5, 6 mM KCl, 0,2 mM MgCl₂ und RNase-freies ddH₂O in einem endgültigen Reaktionsvolumen von 20 μl.
3. Anneal-RNA-Oligos bilden RNA-Duplex durch Erhitzen einer Mischung aus dem Biotin-markierten Oberstrang (2 μM, Endkonzentration) und einem 1,5-fachen seines unmarkierten komplementären Unterstrangs im Annealing-Puffer (Schritt 2.2) bei 95 °C für 5 min und anschließendes Abkühlen langsam auf Raumtemperatur (RT).

>3. Biochemische In-vitro-Assays

1. EMSA und enzymatische Reaktionen
   1. Für den MOV10-Helikase-Aktivitätsassay mischen Sie 50 mM Tris-HCl bei einem pH von 7,5, 20 mM KoAc, 2 mM MgCl₂, 0,01 % NP-40, 1 mM DTT, 2 U/μl RNase-Inhibitor, 10 nM Biotin-markiertes RNA-Substrat, 2 mM Adenosintriphosphat (ATP), 100 nM RNA-Falle und 20 ng MOV10-Protein und ddH₂O in einem endgültigen Reaktionsvolumen von 20 μl. Inkubieren Sie das Reaktionsgemisch 10 min lang bei 37 °C. 30 min und 60 min. Fügen Sie den 5x Stopppuffer hinzu, um die Reaktion zu stoppen.
      Anmerkung: RNA-Falle, ein Biotin-unmarkiertes Oligo mit Sequenz, Komplementarität zum markierten Oligo, das verhindert, dass die abgewickelte dsRNA wieder annealing.
2. Polyacrylamid-Gele
   1. Die Gelplatten (16 cm x 16 cm) und die 1,5 mm breiten Kämme waschen. Montieren Sie die Gelelektrophoreseeinheiten.
   2. Um ein 10%iges Polyacrylamid-Gel herzustellen, mischen Sie 14 mL ddH₂O, 1,25 mL 10x Tris-Borsäure-EDTA (FSME), 8,3 mL 30% Acrylamid, 1,25 mL 50% Glycerin, 187,5 μL 10% frisch zubereitetes Ammoniumpersulfat (APS) und 12,5 μL Tetramethylethylendiamin (TEMED).
   3. Um ein natives Polyacrylamid-Gel mit 20 % herzustellen, mischen Sie 5,5 ml ddH₂O, 1,25 ml 10x TBE, 1,25 ml 50 % Glycerin, 16,7 ml 30 % Acrylamid, 187,5 μl 10 % APS und 12,5 μl TEMED.
   4. Gießen Sie die Acrylamidlösung sofort in das Gel und führen Sie den Kamm ein. Lassen Sie die Mischung ca. 30 min polymerisieren.
3. Gel-Laufen
   1. Entfernen Sie den Kamm und füllen Sie die Tanks mit dem Elektrophorese-Laufpuffer (0,5x FSME).
   2. Spülen Sie die Probenvertiefungen mit 0,5x FSME-Puffer und lassen Sie das Gel dann 30 Minuten lang bei 100 V auf Eis vorlaufen. Ersetzen Sie den laufenden Puffer durch frisches 0,5x FSME.
   3. Laden Sie 20-25 μl Proben in jede Vertiefung.
   4. Verwenden Sie ein natives Acrylamidgel mit 10 % für den EMSA-Assay und ein natives Acrylamidgel mit 20 % für die enzymatischen Assays. Lassen Sie die Elektrophorese bei 100 V auf dem Eisbad laufen, bis der Bromphenolblau-Marker in das untere Viertel des Gels gewandert ist.
4. Zerlegen Sie die Gelplatten und schneiden Sie das Gel ab, indem Sie Ladevertiefungen und ungenutzte Fahrspuren entfernen. Geben Sie das Gel in 0,5x FSME-Puffer.
5. Schneiden Sie das Filterpapier und die Nylonmembran auf die Größe des Gels zu. Befeuchten Sie das saubere Filterpapier und die Nylonmembran vor.
6. Montieren Sie den Stapel für die Übertragung.
   1. Legen Sie die vornasse Membran auf das vornasse Filterpapier.
   2. Lege das Gel auf die Membran.
   3. Decken Sie das Gel mit einer weiteren Schicht vornassem Filterpapier ab.
   4. Entfernen Sie alle Luftblasen, indem Sie eine saubere Pipette von der Mitte zum Rand rollen.
7. Die Proben aus dem Gel werden in einer halbtrockenen elektrophoretischen Apparatur bei 90 mA für 20 Minuten auf die Membran übertragen.
8. Stoppen Sie die Übertragung und trocknen Sie die Membran dann 1 Minute lang auf einem neuen Filterpapier.
9. Vernetzen Sie die Proben, indem Sie die Membran mit 120 mJ/^cm2 für 45-60 s in einem UV-Licht-Vernetzer bestrahlen, der mit 254-nm-Lampen bestückt ist (Auto-Crosslink-Funktion). Trocknen Sie die Membran 30 Minuten lang bei RT an der Luft.
10. Chemilumineszenz-Detektion
    1. Protokoll 1: Verwenden Sie ein handelsübliches Chemilumineszenz-Nukleinsäure-Nachweiskit mit Standardvolumen.
       1. Geben Sie 20 mL Blockierungspuffer in die Membran und inkubieren Sie sie 15-30 Minuten lang unter leichtem Schütteln auf einem Rotator bei 20-25 U/min.
       2. Bereiten Sie eine Konjugat-/Blockierungspufferlösung vor, indem Sie 66,7 μl stabilisiertes Streptavidin-Meerrettich-Peroxidase-Konjugat zu 20 ml Blockierungspuffer hinzufügen.
       3. Entfernen Sie vorsichtig den Blockierungspuffer und ersetzen Sie ihn durch einen konjugierten/blockierenden Puffer. 15 min auf einem Rotator bei 20-25 U/min inkubieren.
       4. Waschen Sie die Membran 4x unter Schütteln bei 40-45 U/min für jeweils 5 min.
       5. Geben Sie 30 ml Substratäquilibrierungspuffer auf die Membran. Inkubieren Sie die Membran 5 Minuten lang unter Schütteln bei 20-25 U/min.
       6. Bereiten Sie die Substratarbeitslösung vor, indem Sie 6 mL Luminol/Enhancer-Lösung zu 6 mL stabiler Peroxidlösung hinzufügen. Vermeiden Sie Licht.
       7. Die Membran vollflächig mit Substratarbeitslösung bedecken und 5 min inkubieren.
       8. Scannen Sie die Membran in einem chemilumineszierenden Bildgebungssystem für 1-3 s.

Tabelle 1: Primer, die zur PCR-Amplifikation der Genfragmente von Meiob und Mov10 verwendet wurden.Die fetten Buchstaben in den Vorwärts- und Rückwärtsprimern sind BamHI- und NotI-Schneidstellen; die kursiven, fetten Buchstaben in einer umgekehrten Grundierung sind XhoI-Schnittstellen; die fetten Buchstaben in den Kästchen geben die Nukleotide an, die der Punktmutation R235A entsprechen.

Bruchstücke	Zündkapseln	Sequenzen (von 5' bis 3')
MEIOB-A	vorwärts	CGGGATCCATGTTACTTTCTTTGATACACTTGCC
	Rückwärts	BEIGCGGCCGCTACTTTTAGCTGTTCCACTG
MEIOB-C	vorwärts	CCGCGTGGATCCATGGAACCAAAATACTTTACAACTTCA
	Rückwärts	CGATGCGGCCGCCTCTTTATTTTCTCTTATATAATTCAGTAG
MEIOB-E	vorwärts	CCGCGTGGATCCATGTTACTTTCTTTGATACACTTGCC
	Rückwärts	CGATGCGGCCGCTAKTTTTAGCTGTTCCAKTG
MEIOB-E-mut	vorwärts	CTCTGATGTGGCAATAAATTTTAAC
	Rückwärts	GTTAAAATTTATTGCCACATCAGAG
MOV10	vorwärts	GACGACGATGACAAGGGATCCATGCCTAGCAAGTTCAGCTGCC
	Rückwärts	GCTTACTCAGCTAAGCTCGAGTCAGAGCTCATTTCTCCACTCTG

Tabelle 2: Sequenzen von DNA/RNA-Substraten, die in dieser Arbeit verwendet wurden.

Zu den Zahlen	Namen	Sequenzen (von 5' bis 3')
Abbildung 2, 5	36 nt ssDNA	5'-Biotin-GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT-3' (DNA)
Abbildung 3	36 nt ssRNA	5'-Biotin-GUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGU-3" (RNA)
Abbildung 4	54 nt 5'-Schwanz-dsRNA	5'-Biotin-ACCGCUGCCGUCGCUCCG-3' (RNA) 5'-ACGAGGGAGAGAGAGAGAGAGAGCGACGGCAGCGGU-3'(RNA)

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Ausrüstung
Zentrifuge	Eppendorf, Deutschland	5242R
Chemilumineszierendes Bildgebungssystem	Tanon, China	5200
Digitaler Sonifer	Branson, Vereinigte Staaten von Amerika	BBV12081048A	450 Watt; 50/60 Hz
Halbtrockenes elektrophoretisches Löschblatt	Hoefer, Vereinigte Staaten von Amerika	TE77XP
Rohr-Revolver	Crystal, Vereinigte Staaten von Amerika	3406051
UV-Licht-Vernetzer	UVP, USA	CL-1000
Materialien
Nylon-Membran	Thermo Scientific, USA	TG263940A
TC-behandelte Kulturschale	Corning, Vereinigte Staaten von Amerika	430167	ca. 100 mm
TC-behandelte Kulturschale	Corning, Vereinigte Staaten von Amerika	430597	ca. 150 mm
Mikroröhrchen Röhrchen	AXYGEN, Vereinigte Staaten von Amerika	MCT-150-C	1,5 mL
Rohre	Corning, Vereinigte Staaten von Amerika	430791	ca. 15 mL
reagenzien
Anti-FLAG M2 Magnetbeads	Sigma, Vereinigte Staaten von Amerika	M8823
Atp	Thermo Scientific, USA	591136
BCIP/NBT-Farbentwicklungskit für alkalische Phosphatase	Beyotime, China	Nr. C3206
CelLyticTM M-Zelllyse-Reagenz	Sigma, Vereinigte Staaten von Amerika	107M4071V
ClonExpress II Klonierungskit in einem Schritt	Vazyme, China	Nr. C112
Chemilumineszierendes Nukleinsäure-Nachweiskit	Thermo Scientific, USA	T1269950
dNTP	Sigma-Aldrich, Vereinigte Staaten von Amerika	DNTP100-1KT
DMEM	Gibco, Vereinigte Staaten von Amerika	10569044
Edta	Invitrogen, USA	AM9260G	0,5 Mio
EDTA-freier Proteasehemmer-Cocktail	Roche, USA	4693132001
EndoFree Maxi Plasmid Kit	Vazyme, China	DC202
FastPure Gel DNA-Extraktions-Mini-Kit	Vazyme, China	Artikel-Nr.: DC301-01
FBS	Gibco, Vereinigte Staaten von Amerika	10437028
FLAG-Peptid	Sigma, Vereinigte Staaten von Amerika	Nr. F4799
Glycerin	Sigma, Vereinigte Staaten von Amerika	SHBK3676
HEPES-Puffer	Sigma, Vereinigte Staaten von Amerika	SLBZ2837	1 Mio.
KOAc	Sangon Biotech, China	Artikel-Nr.: 127-08-02
MgCl2	Invitrogen, USA	AM9530G	1 Mio.
NaCl	Invitrogen, USA	AM9759	5M
NP-40	Amresco, Vereinigte Staaten von Amerika	M158-500ML
Opti-MEM Medium	Gibco, Vereinigte Staaten von Amerika	31985062
Pbs	Gibco, Vereinigte Staaten von Amerika	10010023	pH-Wert 7,4
RNase-Hemmer	Promega, Vereinigte Staaten von Amerika	Nr. N251B
Streptavidin, alkalische Phosphatase	Promega, Vereinigte Staaten von Amerika	Nr. V5591
FSME	Invitrogen, USA	15581044
Tris-HCI-Puffer	Invitrogen, USA	15567027	1 M, pH 7,4
Tris-HCI-Puffer	Invitrogen, USA	15568025	1 M, pH 8,0
Tween-20	Sangon Biotech, China	A600560

Stück .