Immunfluoreszenz-basierte Visualisierung von DNA-Reparaturprotein-Interaktionen

Zusammenfassung

Quelle: de la Peña Avalos, B., et al., Visualisierung der Interaktion von DNA-Reparaturproteinen durch Immunfluoreszenz. J. Vis. Exp. (2020).

In diesem Video beschreiben wir die Immunfluoreszenzmethode, um die Lokalisation der DNA-Reparaturproteine γH2AX und 53BP1 an den Stellen von Doppelstrang-DNA-Brüchen in bestrahlten Zellkernen sichtbar zu machen.

Protokoll

>1. Kernextraktion und Zellfixierung

1. Herstellung von Stammlösungen: 0,2 M PIPES (pH 6,8), 5 M NaCl, 2 M Saccharose, 1 M MgCl₂, 0,1 M EGTA (pH 8,0).
2. Bereiten Sie den nuklearen Extraktionspuffer (NEB) vor: 10 mM PIPES (pH 6,8), 100 mM NaCl, 300 mM Saccharose, 3 mM MgCl₂, 1 mM EGTA (pH 8,0) und 0,5 % (v/v) Triton X-100 in ddH₂O. Mischen, bis es vollständig aufgelöst ist.
3. Bereiten Sie 4 % (v/v) Paraformaldehyd (PFA) vor: Löse 10 ml 16 % ige wässrige PFA-Lösung in 30 ml PBS. Mischen, bis es sich vollständig aufgelöst hat.
4. Waschen Sie die Zellen zu einem geeigneten Zeitpunkt (t=0, 1, 2, 4, 16 h) zweimal mit 1 mL PBS. Entfernen Sie PBS vollständig.
5. Für die Extraktion der Zellkerne werden 200 μl NEB in jede Vertiefung gegeben (das Zytoplasma wird abgebaut, nur der Zellkern bleibt übrig) (Abbildung 1). 2 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren und dann vollständig entfernen.
   Anmerkung: Überschreiten Sie nicht 2 Minuten.
6. Waschen Sie die Zellen mit 1 mL PBS. Entfernen Sie PBS vollständig. Geben Sie PBS vorsichtig hinzu, die Zellen sind in diesem Schritt sehr zerbrechlich.
7. Geben Sie 200 μl 4 % (v/v) PFA zur Zellfixierung in jede Vertiefung. 10 Minuten bei 4 °C inkubieren. PFA vollständig entfernen.
8. Fügen Sie 1 ml PBS.
   hinzu Anmerkung: Die Zellen können in PBS bei 4 °C gelagert werden.

2. Immunfluoreszenz-Färbung

1. Bereiten Sie die Blockierungslösung vor: 5 % BSA (w/v) in PBS auflösen und 0,3 % (v/v) Triton X-100 hinzufügen. Mischen, bis es sich vollständig aufgelöst hat.
2. Verdünnungspuffer vorbereiten: 1 % BSA (w/v) in PBS auflösen und 0,3 % (v/v) Triton X-100 hinzufügen. Mischen, bis es sich vollständig aufgelöst hat.
3. Zum Blockieren geben Sie 200 μl Blockierungslösung in jede Vertiefung. 2 Stunden bei Raumtemperatur oder 16-18 Stunden bei 4 °C inkubieren.
   Anmerkung: Wenn Ziegenantikörper verwendet werden, fügen Sie der Blockierungslösung 5 % Ziegenserum hinzu.
4. Den Primärantikörper in einem Verdünnungspuffer (1:500; siehe Tabelle 1 für die Antikörperliste) verdünnen und vortexen, bis er gut vermischt ist.
   Anmerkung: Wenn Ziegenantikörper verwendet werden, fügen Sie 1 % Ziegenserum zum Verdünnungspuffer hinzu.
5. In eine Feuchtigkeits-/Inkubationsbox kleben Sie ein Stück Parafilm. Fügen Sie 10 μl Primärantikörper (in einem einzigen Tropfen) hinzu. Richten Sie eine Kante des Deckglases mit dem Tropfen aus und senken Sie es langsam auf den Parafilm ab, damit sich die Flüssigkeit überall verteilen kann (Blasen möglichst vermeiden). 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubieren.
6. Waschen Sie die Deckgläser dreimal 1 Minute lang in PBS.
7. Den Sekundärantikörper in einem Verdünnungspuffer (Endkonzentration: 2 μg/ml) verdünnen und vortexen, bis er gut vermischt ist.
8. 10 μl Sekundärantikörper wie für die Primärantikörper beschrieben anwenden. 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubieren.
   Anmerkung: Vor Licht schützen.

Tabelle 1: Verwendete Antikörper. Liste der in dieser Studie verwendeten Antikörper.

) )

Antikörper	Firma	Referenz	Quelle
53BP1	Zelluläre Signalübertragung	Artikel-Nr.: 4937	Kaninchen
Anti-Maus IgG H&L (Alexa Fluor 647)	Abcam (Englisch	AB150103	Esel
Anti-Phospho-Histon H2A. X (Ser139), Klon JBW301	Millipore	Tel. 05-636	Maus
Anti-Kaninchen IgG H&L (Alexa Fluor 488)	Abcam (Englisch	AB150081	Ziege

9. Waschen Sie die Deckgläser dreimal 1 Minute lang in PBS.
10. Waschen Sie die Deckgläser 1 Minute lang mit H₂O.
11. Gegenfärbung der DNA mit DAPI: 10 μl 300 nM DAPI (wie bei Antikörpern beschrieben) auftragen, 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren und dann mit einem Eindeckmedium auf Glycerinbasis auf Objektträger auftragen. Alternativ können Sie einen Tropfen (10 μl) handelsübliches Antifading-Eindeckmedium, das DAPI enthält, auf einen Objektträger geben und ein Deckglas anbringen. Drücken Sie vorsichtig auf das Deckglas und entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit mit einem Papiertuch.
12. Versiegeln Sie Deckgläser mit transparentem Nagellack und lassen Sie sie 20 Minuten trocknen.
13. Lagern Sie die Objektträger bei 4 °C.

3. Bilderfassung

1. Geben Sie einen Tropfen Immersionsöl auf die 60-fach-Objektivlinse. Verwenden Sie DAPI, um die Kerne durch das Okular zu lokalisieren.
   1. Öffnen Sie für die XYZ-Bilderfassung die Erfassungssoftware und wählen Sie die Parameter: Scannertyp: Galvano; Scanner-Modus: Roundtrip; Bildgröße: 512×512; PMT-Modus: VBF; PMT-Durchschnitt: Frame (4x); Sequenzieller PMT-Scan: Linie.
   2. Wählen Sie den Farbstoff und die Detektoren aus:
      Kanal (CH1), Farbstoff (DAPI), Detektor (SD1)
      Kanal (CH2), Farbstoff (Alexa Fluor 488), Detektor (HSD3)
      Kanal (CH3), Farbstoff (Alexa Fluor 647), Detektor (HSD4)
   3. Wählen Sie ON in "Z".
2. Passen Sie das Live-Bild an. Drücken Sie die Live-Taste im Live-Fenster.
   1. Passen Sie den Fokus an und stellen Sie die Laserintensität (%), die Empfindlichkeit (HV), die Verstärkung und den Offset im Werkzeugfenster "PMT" ein.
      1. Passen Sie die Laserintensität (%) für Helligkeit und Bleichen an. Je höher die Laserintensität, desto stärker ist das Signal, aber die Probe wird photobleichiert.
      2. Passen Sie die Empfindlichkeit (HV) an: Geräuschpegel. Je höher der HV, desto stärker das Signal, aber das Bild wird verrauscht, wenn es zu hoch ist.
         HINWEIS: Halten Sie die Spannung immer konstant.
      3. Passen Sie den Versatz an: Hintergrundpegel.
   2. Wählen Sie Start/Ende (15 Slices) für Z-Stapel aus.
3. Starten Sie die Akquise.
   1. Wählen Sie den Ordner aus, in dem die Bilder gespeichert werden sollen. Drücken Sie die LSM-Start-Taste, um mit der Aufnahme des Bildes zu beginnen. Drücken Sie die Schaltfläche Serie fertig, um die Bildaufnahme abzuschließen.

Ergebnisse

Abbildung 1. Nukleare Extraktion.

Repräsentative Bilder von Zellen vor (links) und nach (rechts) Kernextraktion. Das Zytoplasma sollte verdaut werden, aber die Kernstruktur sollte nach der Extraktion intakt bleiben (rechts). (A) 20-fache Vergrößerung; Maßstabsleiste = 20 μm und (B) 40-fache Vergrößerung; Maßstabsleiste = 10 μm.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Deckglas #1, 18 mm rund (Deckgläser)	Neuvitro	NC0308920	Deckgläser müssen vor der Verwendung mit HCl oder Ethanol gereinigt und sterilisiert werden.
DPBS, kein Kalzium, kein Magnesium	Gibco	14190144	PBS für die Gewebekultur
SlowFade Diamond Eindeckmittel gegen Ausbleichen mit DAPI	Invitrogen	Nr. S36973	Stattdessen kann 300 nM DAPI mit VECTASHIELD Antifade Eindeckmedium verwendet werden.
Rinderserumalbumin (BSA)	Sigma-Aldrich	Nr. A3059	Es wird eine Hitzeschockfraktion empfohlen, um Niederschläge/Hintergründe zu vermeiden.
Triton X-100	AmericanBio	AB02025	Puffer für die nukleare Extraktion.
Superfrost Plus Objektträger	Fisherbrand	1255015	Stattdessen können Polysine Slides verwendet werden.