RNA-Protein-Pull-Down-Assay zur Isolierung von RNA-bindenden Proteinen mittels Affinitätsextraktion

Zusammenfassung

Quelle: Kresoja-Rakic, J., et al. Desthiobiotin-Streptavidin-Affinitätsvermittelte Aufreinigung von RNA-interagierenden Proteinen in Mesotheliomzellen. J. Vis. exp. (2018)

Dieses Video zeigt einen in vitro RNA-Pulldown-Assay zur Identifizierung von RNA-bindenden Proteinen (RBPs), die mit den Adenylat-Uridylat-Rich Element (ARE)-Sequenzen in mRNA interagieren. Die Ziel-RBPs aus einem Zelllysat werden mit einer RNA-Sonde gemischt, um RNA-Protein-Komplexe zu bilden. Die Komplexe werden mittels Affinitätsreinigung isoliert, wobei die Affinität der Desthiobiotin-Markierung der RNA-Sonde zu einem Streptavidin-markierten magnetischen Kügelchen genutzt wird.

Protokoll

1. Herstellung der zytosolischen und nukleären Proteinfraktion

1. Platte 4 x 10⁶ ACC-MESO-4-Zellen in einem T150-Zellkulturkolben, gezüchtet in RPMI - 1640 Medium, ergänzt mit 10% FBS, 1x Penicillin/Streptomycin (100x) und 2 mM L-Glutamin (200 mM). Wenn die Zellen einen Zusammenfluss von 80-90% (~5-5,5 x 10⁶ Zellen) erreichen, fahren Sie mit der Proteinextraktion von nuklearen und zytosolischen Fraktionen fort.
   HINWEIS: Die ACC-MESO-4-Zelllinie wurde vom RIKEN BioResource Centre gewonnen.
2. Aspirieren Sie das Medium, waschen Sie die Zellen durch Zugabe von 15 mL 1x PBS, kippen Sie die Platte einige Male vorsichtig und aspirieren Sie das 1x PBS. 3 ml 0,25 % Trypsin-EDTA zugeben und den Kulturkolben 3 Minuten lang bei 37 °C inkubieren.
   ANMERKUNG: Schauen Sie sich die Zellen unter dem Mikroskop an, um sie abzulösen; Wenn der Kolben noch befestigt ist, klopfen Sie ihn 3 Mal gegen die Handfläche.
3. Fügen Sie 7 ml RPMI-1640-Medium hinzu, ergänzt mit 10 % FBS, 1x Penicillin/Streptomycin (100x) und 2 mM L-Glutamin (200 mM), sammeln Sie die Zellen in einem 15-ml-Röhrchen und schleudern Sie es bei 200 x g für 5 min.
4. Aspirieren Sie das Medium und resuspendieren Sie das Zellpellet mit 1,5 mL 1x PBS, dann übertragen Sie die Zellen in ein 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen. Bei 500 x g und 4 °C für 5 Min. runterschleudern. Entsorgen Sie den Überstand.
   HINWEIS: Ab diesem Schritt führen Sie alle Zentrifugationsschritte bei 4 °C durch und halten Sie alle Reagenzien auf Eis.
5. Resuspendieren Sie das Zellpellet mit eiskalten 1,5 mL 1x PBS und schleudern Sie die Zellen bei 500 x g und 4 °C für 3 min herunter. Entsorgen Sie den Überstand.
   HINWEIS: Die erforderlichen Mengen an CER I-, CER II- und NER-Reagenzien betragen 10, 0,55 bzw. 5 Volumina des geschätzten Zellpellet-Packvolumens; Das folgende Protokoll geht von einem Volumen von 20 μl aus. Wir empfehlen, nur die erforderliche Menge an Reagenz CER I vorzubereiten.
6. Fügen Sie 200 μl eiskaltes zytoplasmatisches Extraktionsreagenz (CER I) hinzu, ergänzt mit 2 μl 1x Proteinase-Inhibitor, , z. B. , verdünnen Sie 1 Tablette Protease-Inhibitor (EDTA-frei) in 500 μl Wasser, um die 100-fache Brühe zu erhalten. Diese Menge an Reagenz CER I reicht aus, um 20 μl eines Zellpellet-Volumens zu lysieren.
   1. Um das Packungsvolumen des Zellpellets zu schätzen, vergleichen Sie das Röhrchen mit dem Zellpellet mit einem 1,5-ml-Röhrchen, das mit 10, 20, 50 oder 100 μl 1x PBS gefüllt ist.
7. Resuspendieren Sie das Zellpellet, indem Sie das Röhrchen 15 s lang kräftig vortexen und das Röhrchen 10 Minuten lang auf Eis inkubieren. 11 μl eiskaltes zytoplasmatisches Extraktionsreagenz II (CER II) in das Röhrchen geben, 5 s lang kräftig vortexen und 1 min auf Eis inkubieren.
8. 5 s kräftig vortexen und das Röhrchen bei 16.000 x g und 4 °C für 5 min zentrifugieren. Den Überstand in das saubere, vorgekühlte Rohr auf Eis geben. Der Überstand ist die zytoplasmatische Fraktion, die im RNA-Pulldown-Experiment weiter verwendet wird.
9. Das verbleibende Pellet in 100 μl eiskaltem Kernextraktionsreagenz (NER), ergänzt mit 1 μl Proteinase-Inhibitor (100x), resuspendieren und 15 s lang kräftig vortexen. Wir empfehlen, nur die erforderliche Menge an NER-Reagenz herzustellen, die mit Proteaseinhibitoren ergänzt wird.
10. Inkubieren Sie die Probe 40 Minuten lang auf Eis mit gelegentlichem Vortexen für 15 s (alle 10 Minuten).
11. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 16.000 x g für 10 min. Übertragen Sie den Überstand (dies ist die Kernproteinfraktion) in ein sauberes, vorgekühltes Rohr.
12. Fahren Sie sofort mit der Messung der Proteinkonzentration mit der Bicinchonin-Methode (BCA) fort (siehe Tabelle der Materialien). Um die Proteinreinheit jeder Fraktion zu kontrollieren, führen Sie Immunblotting (Abbildung 1) gegen α-Tubulin (positiver Nachweis nur in der zytosolischen Fraktion) und Poly-ADP-Ribose-Polymerase - PARP (positiver Nachweis nur in der Kernfraktion) durch.
13. Um die Proteinaktivität und ihren nativen Zustand zu erhalten, bereiten Sie 25 μl Aliquots von zytosolischen und nuklearen Extrakten vor. Diese Aliquoten werden 5 s lang in flüssigem Stickstoff eingefroren und direkt bei -80 °C gelagert.

2. Markierung der RNA mit Desthiobiotin

1. Lassen Sie RNA-Sonden kommerziell synthetisieren und HPLC aufreinigen. Resuspendieren Sie mit nukleasefreiem Wasser bei 10 μM.
   HINWEIS: Die Sondensequenzen sind in Tabelle 1 aufgeführt.
2. Verwenden Sie 50 pmol RNA pro RNA-Pulldown-Reaktion. Tauen Sie auf und bewahren Sie alle Reagenzien auf Eis auf, mit Ausnahme von PEG 30%, das zur Markierung des 3'-Terminus des RNA-Oligos verwendet wird.
3. Übertragen Sie 5 μl 10 μM RNA-Sonden, markiert als CALB2 3' UTR (ARE), CALB2 3' UTR (mtARE) und Unrelated-RNA (IRE), in 0,5 mL dünnwandige Mikrozentrifugenröhrchen und inkubieren Sie sie 5 Minuten lang in einer PCR-Maschine bei 85 °C. Legen Sie die Röhren sofort auf Eis.
   HINWEIS: Dieser Schritt ist wichtig, da er die Entspannung und Zugänglichkeit der RNA-Sonde für die Markierung fördert.
4. Für eine einzelne 30-μl-Reaktion geben Sie die folgende 10-μl-Mischung in das RNA-haltige Röhrchen: 3 μl nukleasefreies Wasser, 3 μl 10x RNA-Ligase-Reaktionspuffer, 1 μl RNase-Inhibitor (40 U/μl), 1 μl Desthiobiotinyliertes Cytidinbisphosphat (1 mM) und 2 μl T4-RNA-Ligase (20 U/μl).
   HINWEIS: Um einen Mastermix A für 3 Proben mit mehr als 3,2 Proben (3,2) herzustellen, mischen Sie 9,6 μl nukleasefreies Wasser, 9,6 μl 10x RNA-Ligase-Reaktionspuffer, 3,2 μl RNase-Inhibitor (40 U/μl), 3,2 μl Desthiobiotinyliertes Cytidinbisphosphat (1 mM) und 6,4 μl T4-RNA-Ligase (20 U/μl).
5. Geben Sie vorsichtig 15 μl PEG 30 % in die Reaktion. Verwende einen anderen Tipp, um die Reaktion zu mischen. Die Reaktion wird über Nacht bei 16 °C inkubiert.
6. Bereiten Sie am nächsten Tag Folgendes vor: 5 M NaCl (frisch/nukleasefrei), Chloroform: Isoamylalkohol im Verhältnis 24:1 (z.B. , pro Reaktion - 96 μl Chloroform und 4 μl Isoamylalkohol), eiskaltes 100%iges Ethanol und eiskaltes 70%iges Ethanol.
7. Geben Sie 70 μl nukleasefreies Wasser in die RNA-Markierungsreaktionsröhrchen. 100 μl Chloroform: Isoamylalkohol zugeben und kurz vortexen. Spin-down bei 13.000 x g für 3 Min. Entfernen Sie vorsichtig NUR die obere Phase und geben Sie sie in ein neues nukleasefreies 1,5-ml-Röhrchen; Vermeiden Sie es, die untere Phase zu berühren.
8. Fügen Sie 10 μl 5 M NaCl, 1 μl Glykogen und 300 μl eiskaltes 100%iges Ethanol hinzu. Stellen Sie das Rohr 2 h lang bei -20 °C auf.
   HINWEIS: In diesem Schritt kann das Experiment am nächsten Tag fortgesetzt werden.
9. Zentrifugieren Sie bei 13.000 x g und 4 °C für 15 min. Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig, ohne das Pellet zu stören. 300 μL eiskaltes 70%iges Ethanol zugeben und erneut bei 13.000 x g und 4 °C für 5 min zentrifugieren.
10. Entsorgen Sie den Überstand vollständig und trocknen Sie das Pellet an der Luft (15 min). Resuspendieren Sie das Pellet in 20 μl nukleasefreiem Wasser.
    HINWEIS: Fahren Sie mit dem RNA-Pulldown am selben Tag fort.
11. Inkubieren Sie die RNA bei 90 °C für 2 min und legen Sie sie auf Eis. Legen Sie die markierte RNA während des folgenden Schritts der Vorwäsche der Streptavidin-Magnetkügelchen auf das Eis.
    HINWEIS: Eine längere Inkubationszeit kann die RNA-Sonde beschädigen.

3. RNA-Protein-Pulldown

1. Vorwaschen von Streptavidin-magnetischen Kügelchen und Inkubation mit Desthiobiotin-RNA
   1. Verwenden Sie 50 μl magnetische Streptavidin-Kügelchen pro 50 pmol RNA. Dies sollte jedoch je nach Experiment optimiert werden.
   2. Wirbeln Sie das Röhrchen 15 s lang mit Streptavidin-Magnetkügelchen ein und entfernen Sie schnell 200 μl (Mastermix; ausreichend für 3+1 Reaktionen) mit abgeschnittenen Pipettenspitzen in ein sauberes 1,5-ml-Safe-Lock-Röhrchen. Stellen Sie die Tube so auf einen Magnetständer, dass sich die Kügelchen an der Seite der Tube sammeln, und warten Sie 1 min. Entfernen Sie die Resuspensionsflüssigkeit.
   3. Um die Kügelchen zu waschen, nehmen Sie das Röhrchen vom Magnetständer, fügen Sie 400 μl 0,1 M NaOH und 0,05 M NaCl-Lösung hinzu und pipettieren Sie mehrmals vorsichtig auf und ab. Setzen Sie das Rohr wieder auf den Magnetständer. Warten Sie 1 Minute und sammeln Sie den Überstand ein. Wiederholen Sie diesen Schritt erneut.
   4. Waschen Sie die Kügelchen mit 200 μl 100 mM NaCl. Entfernen Sie den Überstand.
   5. Fügen Sie 200 μl 20 mM Tris (pH 7,5) hinzu, resuspendieren Sie die Kügelchen durch Pipettieren, stellen Sie das Röhrchen auf den Magnetständer, warten Sie 1 Minute und entfernen Sie den Überstand. Wiederholen Sie den Schritt.
   6. Nehmen Sie das Röhrchen vom Magnetständer, fügen Sie 200 μl 1x RNA Capture Puffer hinzu und resuspendieren Sie die Streptavidin-Magnetkügelchen durch kurzes Vortexen. Entfernen Sie 50 μl der magnetischen Streptavidin-Kügelchen und geben Sie sie mit einer abgeschnittenen Pipettenspitze in jedes markierte RNA-Röhrchen. Inkubieren Sie die Röhrchen 30 min lang bei Raumtemperatur auf einer Walze.
2. Bindung des Proteins an RNA
   1. Legen Sie die Röhrchen in einen Magnetständer, warten Sie 1 Minute und entfernen Sie den Überstand.
   2. Geben Sie 50 μl 20 mM Tris (pH 7,5) zu den Kügelchen und resuspendieren Sie sie durch Pipettieren. Legen Sie die Röhrchen in einen Magnetständer, warten Sie 1 Minute und entfernen Sie den Überstand. Wiederholen Sie diesen Schritt.
   3. Geben Sie 100 μl 1x Protein-RNA-Bindungspuffer zu den Kügelchen und resuspendieren Sie sie durch Pipettieren.
   4. In der Zwischenzeit wird folgende Mischung vorbereitet: 10 μl 10x Protein-RNA-Bindungspuffer, 30 μl 50% Glycerin, 50 μg zytoplasmatische Proteine und nukleasefreies Wasser bis zu 100 μl.
      HINWEIS: Bereiten Sie einen Mastermix B für 3 Proben mit mehr als (3,3) wie folgt vor: 33 μl 10x Protein-RNA-Bindungspuffer, 99 μl 50 % Glycerin, 165 μg zytoplasmatische Proteine und nukleasefreies Wasser bis zu 330 μl. Bewahren Sie das Röhrchen mit Mastermix B auf Eis auf.
   5. Legen Sie die Röhrchen in den Magnetständer, warten Sie 1 Minute und sammeln Sie den Überstand. Fügen Sie 100 μl Mastermix B hinzu, resuspendieren Sie ihn durch sanftes Auf- und Abpipettieren und vermeiden Sie die Bildung von Blasen. Reaktionsgefäße 60 min bei 4 °C auf einer Walze inkubieren.
3. Waschen und Elution
   1. Legen Sie die Röhrchen in einen Magnetständer, sammeln Sie den Überstand (der Durchfluss ist - FT) und geben Sie ihn in ein neues Röhrchen.
      HINWEIS: Bewahren Sie diese FT für eine spätere Analyse auf Eis auf.
   2. 100 μl 1x Waschpuffer auf die Kügelchen pipettieren, vorsichtig resuspendieren, wieder in den Magnetständer einsetzen, 1 min warten und den Überstand entsorgen. Wiederholen Sie diesen Schritt 2 Mal.
   3. Geben Sie 40 μl Elutionspuffer zu den magnetischen Beads, mischen Sie durch Auf- und Abpipettieren und inkubieren Sie bei 37 °C auf einem Röhrchenschüttler (950 U/min) für 30 Minuten.
   4. Legen Sie die Röhrchen in einen Magnetständer, warten Sie 1 Minute und sammeln Sie die eluierte Probe (bei der es sich um Eluat - E handelt). Auf Eis legen und für die nachgelagerte Analyse verwenden.
      HINWEIS: In diesem Schritt besteht jede getestete RNA-Sonde aus einer Durchfluss- (FT) und einer Eluat- (E) Probe.

Ergebnisse

Abbildung 1: Western-Blot-Analyse von 5 μg zytosolischer und nukleärer Proteinfraktion. Das PARP-Protein ist in der Kernfraktion (N) vorhanden, fehlt jedoch in der zytosolischen (C) Fraktion. α-Tubulin ist in der zytosolischen Fraktion (C) vorhanden, fehlt jedoch in der Kernfraktion (N).

Tabelle 1: Sequenzen von RNA-Sonden

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
NE-PER Extraktionskit für Kerne und Zytoplasma	Thermo Fisher Scientific	78833
Pierce Proteasehemmer Tabletten, EDTA-frei	Thermo Fisher Scientific	A32965
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	23225
Pierce Magnetic RNA-Protein Pull-Down Kit	Thermo Fisher Scientific	20164	Enthält magnetische Perlen und daher muss das Kit bei 4 Grad gelagert werden; C
Pierce RNA 3' Enddesthiobiotinylierungskit	Thermo Fisher Scientific	20163	Das Kit ist Teil des "Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit" und muss bei -20 & deg gelagert werden. C im Gegensatz zum Pull-Down-Kit (4 > C).
DynaMag-2, magnetisches Stativ	Thermo Fisher Scientific	12321D
RPMI - 1640	medium Sigma-Aldrich	R8758
FBS - filtriertes Rinderserum	Pan Biotech	P40-37500
Penicillin - Streptomycin (100x)	Sigma-Aldrich	P4333
L-Glutaminlösung (200 mM)	Sigma-Aldrich	G7513
0,25% Trypsin-EDTA (1x)	Gibco von Life technologies	25200-056
RNaseZap RNase Dekontaminationslösung	Thermo Fisher Scientific	AM9780
RNA-Oligosynthese	Mycrosynth AG,	Schweiz-Die	Syntheseskala - 0,04 &Mikro; mol - HPLC-gereinigtes
Rinderserumalbumin	Sigma-Aldrich	A7030
Salzsäure (HCl) 6 M	PanReac AppliChem	182883.1211
Ultra Pure 1 M Tris, pH 7,5	Thermo Fisher Scientific	15567027
Glycerin	Thermo Fisher Scientific	17904	50% sterile Aliquote zur Lagerung bei -20°; C
Pierce Streptavidin magnetische Kügelchen	Thermo Fisher Scientific	88817	Bitte beachten Sie, dass diese magnetischen Kügelchen einen durchschnittlichen Durchmesser von 1 & Mikro haben; m (Bereich von 0,5 - 1,5 &Mikro; m). Darüber hinaus werden Dynabeads-M280 Streptavidin, bei denen es sich um Kügelchen mit einer homogenen Größe von 2,8 und Mikro handelt. m, werden auch beim RNA-Pulldown verwendet, aber beachten Sie, dass dies den Reinigungsprozess beeinträchtigen kann.
Aluminiumsulfat-(14-18)-Hydrat	Sigma-Aldrich	368458
Ortho-Phosphorsäure	Applichem	A0637