RNA-Protein-Pull-Down-Assay zur Isolierung von RNA-bindenden Proteinen mittels Affinitätsextraktion

Zusammenfassung

Quelle: Kresoja-Rakic, J., et al. Desthiobiotin-Streptavidin-Affinitätsvermittelte Aufreinigung von RNA-interagierenden Proteinen in Mesotheliomzellen. J. Vis. exp. (2018)

Dieses Video zeigt einen in vitro RNA-Pulldown-Assay zur Identifizierung von RNA-bindenden Proteinen (RBPs), die mit den Adenylat-Uridylat-Rich Element (ARE)-Sequenzen in mRNA interagieren. Die Ziel-RBPs aus einem Zelllysat werden mit einer RNA-Sonde gemischt, um RNA-Protein-Komplexe zu bilden. Die Komplexe werden mittels Affinitätsreinigung isoliert, wobei die Affinität der Desthiobiotin-Markierung der RNA-Sonde zu einem Streptavidin-markierten magnetischen Kügelchen genutzt wird.

Protokoll

1. Herstellung der zytosolischen und nukleären Proteinfraktion

1. Platte 4 x 10⁶ ACC-MESO-4-Zellen in einem T150-Zellkulturkolben, gezüchtet in RPMI - 1640 Medium, ergänzt mit 10% FBS, 1x Penicillin/Streptomycin (100x) und 2 mM L-Glutamin (200 mM). Wenn die Zellen einen Zusammenfluss von 80-90% (~5-5,5 x 10⁶ Zellen) erreichen, fahren Sie mit der Proteinextraktion von nuklearen und zytosolischen Fraktionen fort.
   HINWEIS: Die ACC-MESO-4-Zelllinie wurde vom RIKEN BioResource Centre gewonnen.
2. Aspirieren Sie das Medium, waschen Sie die Zellen durch Zugabe von 15 mL 1x PBS, kippen Sie die Pl....

Ergebnisse

Abbildung 1: Western-Blot-Analyse von 5 μg zytosolischer und nukleärer Proteinfraktion. Das PARP-Protein ist in der Kernfraktion (N) vorhanden, fehlt jedoch in der zytosolischen (C) Fraktion. α-Tubulin ist in der zytosolischen Fraktion (C) vorhanden, fehlt jedoch in der Kernfraktion (N).

Tabelle 1: Sequenzen von RNA-Sonden

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
NE-PER Extraktionskit für Kerne und Zytoplasma	Thermo Fisher Scientific	78833
Pierce Proteasehemmer Tabletten, EDTA-frei	Thermo Fisher Scientific	A32965
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	23225
Pierce Magnetic RNA-Protein Pull-Down Kit	Thermo Fisher Scientific	20164	Enthält magnetische Perlen und daher muss das Kit bei 4 Grad gelagert werden; C
Pierce RNA 3' Enddesthiobiotinylierungskit	Thermo Fisher Scientific	20163	Das Kit ist Teil des "Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit" und muss bei -20 & deg gelagert werden. C im Gegensatz zum Pull-Down-Kit (4 > C).
DynaMag-2, magnetisches Stativ	Thermo Fisher Scientific	12321D
RPMI - 1640	medium Sigma-Aldrich	R8758
FBS - filtriertes Rinderserum	Pan Biotech	P40-37500
Penicillin - Streptomycin (100x)	Sigma-Aldrich	P4333
L-Glutaminlösung (200 mM)	Sigma-Aldrich	G7513
0,25% Trypsin-EDTA (1x)	Gibco von Life technologies	25200-056
RNaseZap RNase Dekontaminationslösung	Thermo Fisher Scientific	AM9780
RNA-Oligosynthese	Mycrosynth AG,	Schweiz-Die	Syntheseskala - 0,04 &Mikro; mol - HPLC-gereinigtes
Rinderserumalbumin	Sigma-Aldrich	A7030
Salzsäure (HCl) 6 M	PanReac AppliChem	182883.1211
Ultra Pure 1 M Tris, pH 7,5	Thermo Fisher Scientific	15567027
Glycerin	Thermo Fisher Scientific	17904	50% sterile Aliquote zur Lagerung bei -20°; C
Pierce Streptavidin magnetische Kügelchen	Thermo Fisher Scientific	88817	Bitte beachten Sie, dass diese magnetischen Kügelchen einen durchschnittlichen Durchmesser von 1 & Mikro haben; m (Bereich von 0,5 - 1,5 &Mikro; m). Darüber hinaus werden Dynabeads-M280 Streptavidin, bei denen es sich um Kügelchen mit einer homogenen Größe von 2,8 und Mikro handelt. m, werden auch beim RNA-Pulldown verwendet, aber beachten Sie, dass dies den Reinigungsprozess beeinträchtigen kann.
Aluminiumsulfat-(14-18)-Hydrat	Sigma-Aldrich	368458
Ortho-Phosphorsäure	Applichem	A0637