SELEX-basierter In-vitro-Bindungsassay zur Identifizierung von RNA-Protein-Wechselwirkungen

>1. Proteinbindungsreaktion und Trennung von gebundener RNA

Die
1. Bindung von Protein und RNA in 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 in einem Volumen von 100 μl wird durch Zugabe der folgenden Bestandteile zu diesen Endkonzentrationen durchgeführt: 50 mM KCl, 1 mM DTT, 0,09 μg/μl Rinderserumalbumin, 0,5 Einheiten/μl RNasin, 0,15 μg/μl tRNA, 1 mM EDTA, und 30 μl einer geeigneten Konzentration an rekombinanten Proteinen (PTB). Fügen Sie RNA aus dem entsprechenden Pool hinzu.
   Anmerkung: Der Spleißfaktor U2AF65 bindet typischerweise an die Polypyrimidin-Trakt/3'-Spleißstellen von Modell-Introns mit einer Bindungsaffinität (Gleichgewichtsdissoziationskonstante oder K_d) von etwa 1–10 nM. Daher wurde in den ersten beiden Bindungsrunden eine Proteinkonzentration verwendet, die 10-fach über dem K_d für U2AF65 liegt; für SXL- und PTB-Proteine war die Ausgangskonzentration in diesem Bereich nur unsere beste Schätzung. Dadurch wurde sichergestellt, dass die gewünschten RNA-Spezies binden konnten, obwohl möglicherweise auch Sequenzen mit geringerer Affinität gebunden waren. In den Runden 3 und 4 (Transkription, Bindung und Amplifikation) wurde die Proteinkonzentration um das Dreifache reduziert. Dies geschah, um RNA-Spezies mit geringer Affinität erfolgreich zu eliminieren.
2. Die Röhrchen mit den Bindungsreaktionen für ca. 30 min bei 25 °C in einen Temperaturblock (oder auf Eis) stellen.
3. Fraktionieren Sie die gebundene RNA von der ungebundenen RNA für die ersten 4 Runden der Selektion-Amplifikation mit den folgenden Schritten.
   1. Die Probe (100 μl) bei Raumtemperatur durch einen Nitrozellulosefilter filtrieren, der an einem Vakuumverteiler befestigt ist.
      Anmerkung: Der RNA-Protein-Komplex, nicht aber die ungebundene RNA, verbleibt auf dem Filter.
   2. Zerkleinern Sie den Filter mit der zurückgehaltenen RNA mit einer sterilen Rasierklinge in Fragmente und führen Sie diese in ein Zentrifugenröhrchen ein. Gewinnen Sie RNA zurück, indem Sie das Röhrchen mindestens 3 Stunden lang (oder über Nacht) vorsichtig mit Filterstücken trommeln, die in den Proteinase K (PK)-Puffer getaucht sind.
   3. Deproteinisieren Sie die RNA-Probe, indem Sie sie in Gegenwart eines gleichen Volumens an Phenol-Chloroform (1:1) und dann von Chloroform vortexen. Die wässrige Phase wird jedes Mal zurückgewonnen, indem die Probe 5 Minuten lang bei Raumtemperatur bei hoher Geschwindigkeit zentrifugiert wird.
   4. Mischen Sie es mit Natriumacetat (0,1 Volumen von 3,0 M, pH 5,2) und Ethanol (2–3 Volumen von absolutem Ethanol, 200 Proof). Lassen Sie das Röhrchen 30 Minuten lang in einem Gefrierschrank bei -80 °C, zentrifugieren Sie es 10 Minuten lang bei hoher Geschwindigkeit und lösen Sie die RNA nach den Wasch- und Trocknungsschritten in mit DEPC behandeltem Wasser auf.
4. Trennen Sie die proteingebundenen RNA-Fraktionen von den ungebundenen Fraktionen für die letzten 2 Runden (Runden 5 und 6; Transkription, Bindung und Amplifikation) wie folgt. Reduzieren Sie die Proteinkonzentration in der Bindungsreaktion (Schritt 1.1) um das weitere Dreifache, um zusätzlichen Selektionsdruck zu erzeugen, um Bindungssequenzen mit hoher Affinität anzureichern und bevorzugt Sequenzen mit niedriger Affinität zu entfernen.
   1. Ein natives Polyacrylamid-Gel (5% mit einem Acrylamid:Bis-Acrylamid-Verhältnis von 60:1) wird in 0,5x TBE-Puffer (Tris-Borat-EDTA) vorgegossen, bevor die obige RNA:Protein-Bindungsreaktion (Schritt 1.1) aufgebaut wird. Elektrophorese dieses Gel in einem kalten Raum (4 °C), indem Sie 15 Minuten lang 250 V anlegen.
   2. Pipettieren Sie die oben genannten RNA:Protein-Bindungsreaktionen (Schritt 1.1) in verschiedene Vertiefungen dieses Gels.
      Anmerkung: Das Protein wird bei -80 °C gelagert und vor der Verwendung in 20 mM 4-(2-Hydroxyethyl)piperazin-1-ethansulfonsäure (HEPES), pH 8,0, 20 % Glycerin, 0,2 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 0,05 % NP-40 und 1 mM Dithiothreitol (DTT) verdünnt. Die Zugabe von 0,5–1,0 mM Proteasehemmer Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF) ist optional. In der Bindungsreaktion trägt dieser Puffer etwa 6 % Glycerin bei, was das direkte Laden von Proben in die Vertiefungen ermöglicht, ohne dass sie mit einem separaten Gel-Ladepuffer gemischt werden müssen.
   3. Fraktionierung der gebundenen RNA von der ungebundenen RNA mittels Gelelektrophorese in einem Kühlraum (4 °C) bei 250 V für 1 bis 2 h. Dieser Prozess wird auch als Gel-Mobility-Shift-Assay bezeichnet.
      HINWEIS: Die Dauer der Elektrophorese variiert je nach den Merkmalen der RNA und des Proteins, die für die Bindung verwendet werden.
   4. Setzen Sie das Gel einem Röntgenfilm aus und identifizieren Sie die Position der gebundenen RNA mittels Autoradiographie. Schneide die Gelscheibe mit der gebundenen RNA aus und führe sie in ein Röhrchen ein.
   5. Inkubieren Sie die zerkleinerte Gelscheibe in dem PK-Puffer, der für die Elution verwendet wird, für 3 Stunden oder über Nacht.
   6. Die eluierte RNA-Probe wird zuerst mit Phenol-Chloroform und dann mit Chloroform kräftig vortext.
   7. Mischen Sie Natriumacetat und Ethanol mit der wässrigen Phase nach der Chloroform-Extraktion. Nach der Inkubation in einem -80 °C-Gefrierschrank 5–10 Minuten lang bei 4 °C drehen, um das RNA-Pellet zu sammeln. Waschen Sie das RNA-Pellet mit Ethanol und trocknen Sie es an der Luft, indem Sie den Deckel des Röhrchens offen lassen. Die RNA wird in Wasser gelöst, das mit DEPC.
      behandelt wurde. Anmerkung: Der Wechsel zum Gel-Mobility-Shift-Assay für die Fraktionierung ermöglicht die Eliminierung unerwünschter RNA-Spezies, die möglicherweise für die Bindung angereichert wurden, z. B. an den Nitrozellulosefilter hier (oder eine beliebige Matrix), die in den ersten Runden für die Fraktionierung verwendet wurde.

>2. Reverse Transkription und PCR-Amplifikation

1. Synthetisieren Sie cDNA aus der gelösten RNA unter Verwendung der reversen Transkriptase und des reversen Primers, indem Sie die 20 μL-Reaktion (2 μl 10x RT-Puffer, 2 μl AMV-reverser Transkriptase, 1 μM reverser Primer, 10 μl RNA, RNase-Inhibitor optional) bei 42 °C für 60 min inkubieren.
2. Amplifizieren Sie die cDNA mit 20–25 PCR-Zyklen. Binden Sie den T7-RNA-Polymerase-Promotor durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) an die Bibliothek, die 1 μM DNA-Zufallsbibliotheksvorlage, 1 μM von jedem Primer, 20 mM Tris (pH 8,0), 1,5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 0,1 μg/μl acetyliertes Rinderserumalbumin, 2 Einheiten Taq-Polymerase und je 200 μM dNTPs (Desoxyguanosin, Desoxyadenosin, Desoxycytidin und Desoxythymidintriphosphat).

>3. Transkription und Proteinbindung

1. Wiederholen Sie den Prozess der RNA-Synthese, der Proteinbindung und der Trennung von proteingebundenen und ungebundenen Fraktionen.