Mikroskalige Thermophorese zur Untersuchung von Protein-Lipid-Wechselwirkungen in Lösung

Zusammenfassung

Quelle: Sparks, R. P. et al., Verwendung der mikroskaligen Thermophorese zur Messung von Protein-Lipid-Wechselwirkungen.J. Vis. Exp.(2022)

Dieses Video demonstriert die mikroskalige Thermophorese zur Untersuchung der Protein-Lipid-Wechselwirkung. Der Assay detektiert die Wechselwirkung zwischen Molekülen, indem er die thermophoretische Bewegung von fluoreszenzmarkierten Proteinen als Reaktion auf einen Temperaturgradienten quantifiziert. Das fluoreszierende Molekül wird mit unterschiedlichen Konzentrationen der nicht fluoreszierenden Lipidmoleküle gemischt, und das Molekülgemisch in der Lösung wird in Kapillaren geladen. Dabei wird ein Temperaturgradient auf die Proben in den Kapillaren angewendet, und die Bewegung des fluoreszierenden Moleküls im Temperaturgradienten wird erfasst und aufgezeichnet.

Protokoll

>1. Vorbereitung der Materialien

1. Bereiten Sie phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) vor: 137 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM NaH₂PO₄ und 2 mM KH₂PO_4, pH 7,4.
2. Bereiten Sie den Farbstoff NTA-Atto 647 N vor. Der Farbstoff NTA-Atto 647 N aus einer 100%igen DMSO-Lösung wird ohne Tween in PBS auf 100 nM verdünnt.
3. Exprimieren Sie Vam7-His8 – Protein als Fusionsprotein in E. coli und reinigen Sie es mittels Ni-NTA und Größenausschlusschromatographie.
4. Titrieren Sie den Analyten in PBS-Puffer. Befindet sich der Analyt in einem anderen Puffer, ist markiertes MST nicht besonders empfindlich gegenüber geringfügigen Pufferunterschieden von Molekülen wie DMSO, es sei denn, der Inhalt des Analytpuffers interagiert mit dem markierten Protein.

>2. Vorbereitung des MST-Geräts

1. Schalten Sie den Netzschalter auf der Rückseite des Geräts ein.
2. Öffnen Sie die Steuerungssoftware, und stellen Sie sicher, dass sich der Laptop auf dem an das Gerät angeschlossenen Computer im verbundenen Status befindet.
3. Geben Sie die Fluoreszenz- und MST-Einstellungen für dieses Experiment ein. Stellen Sie MST Before auf 3 s, MST auf 30 s und Fluoreszenzwiederherstellung (Fluo) ein.nach 1 s. Before misst die anfängliche Fluoreszenz und erfordert keine langen Zeiten; MST ist die tatsächliche Zeitspanne, die nach der Wärmeinduktion bis zum Erreichen des Gleichgewichts erreicht wird.
4. Tabelle der Kapillaren: Geben Sie für jedes Kapillarröhrchen den Namen des Ziels (Liganden), den Namen des Liganden (Analyten), die Konzentration des Ziels und die höchste Titrationskonzentration ein und verwenden Sie das Autofill-Titrationsverhältnis. Geben Sie z. B. 50 nM für die Zielkonzentration von Vam7-His8, Vam7-His8 für den Zielnamen, (1,2-Dioctanoylphosphatidsäure) Di-C8 PA als Ligandennamen und die höchste Konzentration des Liganden ein, indem Sie 1:1 auswählen und nach unten zu den Autofill-Slots 2-16 ziehen.
5. Führen Sie einen Cap-Scan durch, um die geeignete LED (20% LED (Preset)) basierend auf dem Signal des Zielproteins auszuwählen, und stellen Sie zwischen 200 und 2000 Fluoreszenzeinheiten für markierte MST ein. Cap-Scans sollten gleichmäßig abgerundete, glockenförmige Peaks zeigen.
6. Wählen Sie einen Bereich von MST-Potenzen aus und geben Sie für jede Leistung Werte ein, um die robusteste Bindungspassung zu testen, und klicken Sie auf Cap Scan + Messung starten, wobei Sie verschiedene Werte scannen, um die besten Betriebsbedingungen für die jeweilige zu testende Interaktion zu ermitteln.
7. Bestimmen Sie die MST-Leistung mit der besten Anpassung mithilfe der Analysesoftware und der Voreinstellung für die Thermophorese mit Tjump. Analysieren Sie die Passungen nach dem größten Fluoreszenzabstand zwischen niedrigster und höchster Konzentration im Vergleich zur MST-Leistung mit der besten Anpassung und wählen Sie die MST-Leistung für Replikationsversuche.
8. Stellen Sie fest, ob zwischen dem ersten und zweiten Durchlauf Photobleaching aufgetreten ist, indem Sie die Analysesoftware aufrufen und die Analyse in den Expertenmodus schalten. Wählen Sie als Nächstes Fluoreszenz anstelle von Thermophorese für die Analyse. Wählen Sie den Expertenmodus und dann das Photobleaching.

>3. Vorbereitung von Proben für markierte MST

1. Bringen Sie die Vam7-His8-Lösung auf eine Konzentration von 200 nM in PBS ohne Tween.
2. Bringen Sie den Farbstoff NTA-Atto 647 auf 100 nM in PBS ohne Tween.
3. Mischen Sie den Farbstoff Vam7-His8 und NTA-Atto 647 in einem Volumenverhältnis von 1:1 und lassen Sie ihn 30 Minuten lang bei Raumtemperatur lichtgeschützt stehen. Bestimmen Sie die geeignete Konzentration des Zielproteins wie in Abschnitt 2.5 (siehe Ergänzung zur Verwendung von KD des Ni-NTA-Farbstoffs, wie im Video gezeigt).
4. Zentrifugengemisch aus NTA-Atto 647 N Farbstoff und Protein für 10 min in einem dunklen Raum mit einer Tischzentrifuge bei ca. 8.161 x g.
5. Lagern Sie die Mischung nach dem Experiment bei 4 °C oder während des Experiments auf Eis, um sie bei Bedarf innerhalb weniger Stunden wiederzuverwenden, um eine Denaturierung des Proteins zu verhindern.
6. Verwenden Sie den NT-Konzentrationsfinder, um den für die Titration erforderlichen Konzentrationsbereich zu bestimmen.
7. Bringen Sie Di-C8 PA auf die entsprechende maximale Konzentration im Wasser.
8. Titrieren Sie den Analyten mit einer seriellen Verdünnung von 1:1 in PBS-Puffer für 16 Konzentrationen basierend auf dem vorherigen Schritt. Im Gegensatz zur SPR ist die Thermophorese nicht so empfindlich gegenüber Pufferunterschieden.

>4. MST von Proben

1. Schalten Sie das Gerät und den angeschlossenen Laptop ein.
2. Drücken Sie den Pfeil nach oben an der Vorderseite der Maschine und schieben Sie das Kapillargestell heraus.
3. Laden Sie Kapillaren in das Rack mit der höchsten Konzentration an Position 1.
4. Wählen Sie in der Steuerungssoftware den roten Kanal aus, der NTA-Atto 647 N entspricht.
5. Geben Sie Informationen zu Konzentration, Position und Namen für jede Kapillare in die Tabelle der Kapillaren ein.
6. Führen Sie einen Kapillarscan durch, indem Sie auf Start Cap Scan bei 20 % LED (voreingestellt) drücken und entsprechend zwischen 200 und 2000 Fluoreszenzeinheiten einstellen, indem Sie entweder die LED-Intensitätseinstellungen oder die Konzentration des Liganden (markiertes Protein) verwenden.
7. Wählen Sie einen MST-Leistungsbereich aus.
8. Starten Sie den Kappenscan + MST-Messung.
9. Analysieren Sie mit der Analysesoftware.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Cy5 Maleimid-Monoreaktivfarbstoff	GE Gesundheitswesen	PA23031	Für die Proteinmarkierung
GraphPad Prisma	GraphPad-Software
Monolith NT.115 Kapillaren (1000 Stück)	Nano-Temperierung	MO-K022	Kapillaren für MST
Monolith NT.115 Maschine	Nano-Temperierung		Ausstattung der Universität
NTA-Atto 647 N	Sigma	Nr. 2175	Beschriftung für His-Tags
Phosphatidylinositol-3-phosphat diC8 (PI(3)P diC8)	Echelon	Nr. P-3008	Lipid für Bindungsexperimente