Quantitative Durchflusszytometrie zur Untersuchung markierter Protein-Phospholipid-Vesikel-Wechselwirkungen

Zusammenfassung

Quelle: Podoplelova, N. et al., Analyse der Wechselwirkung von fluoreszenzmarkierten Proteinen mit künstlichen Phospholipid-Mikrovesikeln mittels quantitativer Durchflusszytometrie. J. Vis. Exp. (2022)

In diesem Video demonstrieren wir die Interaktion zwischen Proteinen und künstlichen Phospholipid-Vesikeln mittels quantitativer Durchflusszytometrie. Die Bindung von fluoreszenzmarkierten Proteinen an fluoreszenzmarkierte Phospholipid-Vesikel erhöht die mittlere Fluoreszenzintensität, und dieser Anstieg wird mit einem Durchflusszytometer nachgewiesen.

Protokoll

>1. Nachweis der Protein-Lipid-Wechselwirkung durch Durchflusszytometrie

1. Kinetische Bindungsexperimente
   1. Verdünnen Sie Phospholipid-Vesikel in Tyrode-Puffer (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 0,4 mM NaH₂PO₄, 2,5 mM CaCl₂, 5 mM Glukose, 0,5 % BSA, pH 7,4) auf eine Konzentration von 1 μM und ein Gesamtvolumen von 250 μl.
   2. Mischen Sie den fluoreszenzmarkierten Gerinnungsfaktor X (fX-fd) aus Schritt 1 in einer Konzentration von 500 nM mit den Phospholipid-Vesikeln aus Schritt 1.1.1 im Verhältnis 1:1 (endgültige Vesikelkonzentration 0,5 μM, fX-fd-Konzentration beträgt 250 nM fX) zu einem Gesamtvolumen von 500 μL.
   3. Injizieren Sie sofort die 500 μl der gemischten Suspension (~20 min für die Analyse mit niedriger Durchflussrate) in das Durchflusszytometer. Verwenden Sie einen niedrigen Durchfluss und stellen Sie sicher, dass der Schwellenwert für Kanal FL2 (Anregung 488 nm, Emissionsfilter 585/42 nm) bei Wert 200 liegt. Messen Sie die mittlere Fluoreszenz im Kanal FL4 (Anregung 633 nm, Emissionsfilter 660/20) für den Fluoreszenzfarbstoff aus der Materialtabelle.
      Anmerkung: Wählen Sie ein Zytometer ohne Autosampler. Dies beschleunigt den Prozess der Injektion der Probe in die Messzelle.
   4. Wenn die Sättigung der Bindung erreicht ist (kein signifikanter Anstieg der Fluoreszenz innerhalb von 5 Minuten), verdünnen Sie die Probe schnell um das 20-fache mit Tyrode-Puffer und überwachen Sie die Dissoziation, bis die Ausgangsfluoreszenz erreicht ist (vollständige Dissoziation) oder bis ein Plateau erreicht ist (keine signifikante Abnahme der Fluoreszenz innerhalb von 5 Minuten).
      Anmerkung: Als Kontrolle fügen Sie 10 μM EDTA hinzu und überwachen Sie die vollständige Dissoziation für 5 Minuten.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Alexa Fluor 647 NHS-Ester (Succinimidylester)	Thermo Fisher Scientific	Nr. A37573	Fluoreszierender Farbstoff
BD FACSCantoII	BD Biowissenschaften
DiIC16(3) (1,1'-Dihexadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyaninperchlorat)	Thermo Fisher Scientific	Nr. D384	Fluoreszierender Farbstoff
Dmso	Sigma Aldrich	Nr. D8418
HEPES	Sigma Aldrich	H4034-500G
L-α-Phosphatidylserin (Gehirn, Schwein) (Natriumsalz)	Avanti Polare Lipide	840032P
L-α-Phosphatidylcholin (Gehirn, Schwein)	Avanti Polare Lipide	840053P
Mini-Extruder	Avanti Polare Lipide	Artikel-Nr.: 610020-1EA
Kaliumchlorid	Sigma Aldrich	P9541-500G
Calciumchlorid, wasserfrei, Pulver, ≥97%	Sigma Aldrich	Nr. C4901-100G
Natriumphosphat einbasisch	Sigma Aldrich	Nr. S3139-250G
Natriumchlorid	Sigma Aldrich	Nr. S3014-500G
Magnesiumchlorid	Sigma Aldrich	M8266-100G
Rinderserumalbumin	VWR Life Science AMRESCO	AM-O332-0.1
EDTA-Dinatriumsalz	VWR Life Science AMRESCO	AM-O105B-0.1