HINWEIS: Puffer sollten mit einem 0,22-μm-Filter gefiltert und 1 h lang durch ein Vakuum entgast werden.
>1. Vorbereitung von Lipid-Vesikeln
- Verwenden Sie 2-ml-Glasröhrchen. Jedes Lipid, 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DOPC), 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (POPC), 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serin (POPS) und Cholesterin (Chol) werden in einem Gemisch aus Chloroform/Methanol (50:50 v/v) gelöst, um eine klare 5 mM Lipidlösung herzustellen. 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-myo-inositol-4',5'-bisphosphat) (PI(4,5)P2) wird in einem Gemisch aus Chloroform/Methanol/Wasser (20:9:1 v/v) gelöst.
- Kombinieren Sie die gelösten Lipide im gewünschten molaren Verhältnis von POPC/POPS (80/20), POPC/PI(4,5)P2 (95/5), POPC/POPS/Chol (60/20/20), POPC/POPS/PI(4,5)P2/Chol (60/17/3/20) und POPC/DOPC/POPS/PI(4,5)P2/Chol (37/20/20/3/20) (Tabelle 1) in 10-ml-Glasröhrchen.
Anmerkung: Die endgültige Menge an Gesamtlipid beträgt 500 μg.
- Verdampfen Sie die organischen Lösungsmittel mit einem trockenen Stickstoffstrahl. Lassen Sie das Lipidgemisch 3 h lang in einem Hochvakuumsystem (Lyophilisationssystem), um alle Reste der Lösungsmittel zu entfernen.
Anmerkung: Dadurch entsteht ein trockener, klarer Film.
- Resuspendieren Sie den Lipidfilm in 1 ml Citratpuffer (10 mM Trinatriumcitrat, 150 mM NaCl, pH 4,6). Die Lipidsuspension wird bei 60 °C (diese Temperatur liegt etwa 10 °C über der Phasenübergangstemperatur des höchsten schmelzenden Lipids in der Mischung) 30 min lang in einem Wasserbad inkubiert und alle 5 min kräftig gewirbelt< br />
Anmerkung: Dabei kommt es zur Bildung von großen, mehrlamellären Vesikeln (MLVs). Halten Sie die Federung über der Übergangstemperatur.
- Heizen Sie den Extruder (in diesem Fall bei 60 °C), der mit einer porengroßen Polycarbonat-Membran mit einem Durchmesser von 50 nm ausgestattet ist, über der Sprungtemperatur (hier 40 - 50 °C) für 30 min vor.
- Laden Sie die MLV-Suspension in den vorgewärmten Extruder und leiten Sie das Gemisch vorsichtig 31x durch die Polycarbonatmembran, um kleine unilamellare Vesikel (SUVs) zu bilden. Halten Sie die Temperatur über der Sprungtemperatur.
- Übertragen Sie die SUV-Suspension in ein 2-ml-Reaktionsgefäß aus Kunststoff und fügen Sie den Citratpuffer hinzu (siehe Schritt 1.4), um das endgültige Volumen auf 2 mL zu bringen.
Anmerkung: Dies ergibt eine endgültige Lipidkonzentration von 250 μg/ml.
>2. Umgang mit den Quarzsensoren
HINWEIS: Fassen Sie die Quarzsensoren immer mit einer Pinzette an.
- Vier Sensoren, die in einen Polytetrafluorethylen-Halter eingesetzt werden, ≥ 30 Minuten lang in einer 2%igen SDS-Lösung inkubieren. Waschen Sie sie ausgiebig mit Reinstwasser, um das SDS vollständig zu entfernen, und lassen Sie sie mit einem Strahl trockenem Argon oder Stickstoff trocknen.
- Verwenden Sie ein Plasmareinigungssystem, um alle Verunreinigungen vollständig zu entfernen. Setzen Sie die trockenen Sensoren in die Plasmareinigungskammer ein, evakuieren Sie die Kammer und spülen Sie sie 3x mit Sauerstoff. Schalten Sie den Plasmareiniger ein. Verwenden Sie die folgenden Prozessparameter: 1 x 10-4 Torr Druck, hohe Hochfrequenzleistung (RF) und 10 Minuten Prozesszeit. Schalten Sie die Maschine aus und nehmen Sie die Sensoren heraus.
>3. Funktionsweise der Mikrowaage
HINWEIS: Es wurde ein Mikrowaagensystem mit vier temperaturgesteuerten Durchflusskammern in paralleler Konfiguration verwendet, das mit einer Peristaltikpumpe verbunden und auf eine Durchflussrate von 80 μL/min eingestellt ist. Im Open-Flow-Modus wurde der Puffer aus dem Zubringerbehälter in den Auffangbehälter gepumpt. Im Loop-Modus wurde der Vorratsbehälter mit dem Zubringerbehälter verbunden, um einen geschlossenen Kreislauf zu erzeugen. Die Temperatur wurde auf 20 °C eingestellt.
- Docken Sie die plasmagereinigten Sensoren vorsichtig mit einer Pinzette in die 4 Durchflusskammern ein. Vermeiden Sie jeglichen Druck oder Verdrehung der Kammern und der Rohre, die zu Undichtigkeiten führen könnten.
- Spülen Sie das System mit Citratpuffer (10 mM Trisodiumcitrat, 150 mM NaCl, pH 4,6) im Open-Flow-Modus für 10 min.
Anmerkung: Dies erfordert genau 3,2 mL Puffer, aber es ist ratsam, einen überschüssigen Puffer (10 mL) zu verwenden.
- Starten Sie das Programm. Beginnen Sie mit der Aufzeichnung aller Änderungen der Frequenz und der Verlustleistung des ersten Grundtons (n = 1.) und der Obertöne (n = 3. - 13.) mit der Software, bis die Frequenz- und Verlustbasislinien stabil sind (dies dauert ca. 40 - 60 Minuten).
Anmerkung: Der Frequenzrauschpegel (Spitze-Spitze) sollte kleiner als 0,5 Hz und für die Verlustleistung kleiner als 0,1,10-6 sein, mit einer maximalen Drift (in wässriger Lösung) von 1 Hz/h in der Frequenz und 0,3,10-6/h in der Verlustleistung.
- Wenn die Ausgangswerte stabil sind, tragen Sie die SUV-Suspension in Citratpuffer (2 ml in einem kleinen Röhrchen) auf. Entfernen Sie mit einem Reaktionsgefäß 1,5 ml des Totvolumens. Schließen Sie dann das System im Loop-Flow-Modus. Nehmen Sie die Frequenz-/Verlustverschiebung für weitere 10 Minuten auf.
Anmerkung: Während dieser Zeit breiten sich die Vesikel auf der SiO2-Oberfläche aus und verschmelzen zu einer kontinuierlichen Doppelschicht (Schritt 2 in den Abbildungen 1, 2 und 3). Die Adsorption des SUV an der Oberfläche des Sensors ist zweiphasig und hat ein typisches Frequenzminimum und -maximum in der Verlustleistung. Eine stabile neue Frequenz-/Verlustbasislinie mit einer charakteristischen Frequenzverschiebung (abhängig von der Lipidzusammensetzung) von 26 - 29 Hz (siehe Tabelle 1) deutet auf eine kontinuierliche Doppelschicht auf der Oberfläche hin.
- Wenn der SLB stabil ist (siehe Schritt 3.4), äquilibrieren Sie das System mit dem laufenden Puffer (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,4) bei den erforderlichen Ca2+-Konzentrationen (je nach Experiment von 50 μM bis zu 1 mM CaCl2) in einem Open-Flow-Modus für 40 min.
- Geben Sie das Protein (hier AnxA2) in den laufenden Puffer, der Ca2+ enthält (siehe Schritt 3.5). Führen Sie die Anwendung des Proteins in einem Loop-Flow-Modus durch, bis ein stationärer Gleichgewichtszustand erreicht ist (Schritt 3 in Abbildung 1, Abbildung 2 und Abbildung 3).
Anmerkung: Die Proteinkonzentration kann zwischen 1 und 400 nM liegen. Die Proteinadsorption führt zu einer konzentrationsabhängigen Frequenzverschiebung, die die Massenadsorption (Protein) widerspiegelt.
- Dissoziieren Sie das gebundene Protein durch Chelatisierung von Ca2+-Ionen mit 5 mM EGTA im laufenden Puffer im Open-Flow-Modus (Schritt 4 in Abbildung 1 und Abbildung 2).
Anmerkung: Eine Wiederherstellung der Frequenz und der Dissipation zur SLB-Basislinie deutet auf eine vollständige Reversibilität der Proteinbindung hin. Assoziations-Dissoziationszyklen können wiederholt werden, um verschiedene Konzentrationen oder Proteine zu vergleichen.
