Einzelmolekül-Bildgebung zur Visualisierung der Ansammlung von Fusionsprotein-Kondensaten auf DNA-Vorhängen

Zusammenfassung

Quelle: Zuo, L. et al., Einzelmolekül-Bildgebung von EWS-FLI1-Kondensaten, die sich auf DNA ansammeln. J. Vis. Exp. (2021)

Dieses Video beschreibt eine Methode, um die Assemblierung von Fusionsprotein-Kondensaten auf DNA-Molekülen an bestimmten Loci mit Hilfe von Einzelmolekül-Bildgebung zu visualisieren. Diese Kondensate werden durch LCD-LCD- und LCD-DBD-Wechselwirkungen gebildet, die die Rekrutierung von RNA-Polymerase II und eine verbesserte Gentranskription ermöglichen.

Protokoll

>1. Bildgebung der EWS-FLI1-Kondensationsbildung auf DNA-Vorhängen

1. Öffnen Sie die Bildgebungssoftware, suchen und markieren Sie die Positionen der 3 × 3 Zick-Zack-Muster unter dem Hellfeld.
2. Schalten Sie den Durchfluss bei 0,2 mL/min ein, um die DNA 10 Minuten lang mit dem doppelsträngigen DNA-Farbstoff zu färben.
3. mCherry-EWS-FLI1 wird mit dem Imaging-Puffer auf eine Konzentration von 100 nM in 100 μl im Röhrchen verdünnt.
4. Laden Sie die Proteinprobe mit einer 100-μl-Glasspritze durch das Ventil und ändern Sie die Flussrate auf 0,4 mL/min.
5. Schalten Sie den 488-nm-Laser ein und scannen Sie jede Region vor, um den Zustand der DNA-Verteilung zu überprüfen. Wählen Sie die Region aus, in der sich die DNA-Moleküle gleichmäßig verteilen. Stellen Sie die Laserleistung auf 10 % für den 488-nm-Laser und 20 % für den 561-nm-Laser ein. Verwenden Sie das Leistungsmesser, um die tatsächliche Laserleistung in der Nähe des Prismas zu messen: 4,5 mW für den 488-nm-Laser und 16,0 mW für den 561-nm-Laser.
6. Bilderfassung
   1. Beginnen Sie mit der Aufnahme von Bildern in 2-s-Intervallen mit 488-nm- und 561-nm-Lasern gleichzeitig.
   2. Wechseln Sie das Ventil vom manuellen in den Injektionsmodus, damit der Bildgebungspuffer die Proteinprobe nach 60 s.
      in die Durchflusszelle spülen kann Anmerkung: Dieser Prozess wird ~30 s dauern, und das Sichtfeld wird mit mCherry-Signalen bedeckt sein, sobald die EWS-FLI1-Proteine die Flusszelle erreichen.
   3. Um freies EWS-FLI1 zu entfernen, waschen Sie die Durchflusszelle 5 Minuten lang mit dem Bildgebungspuffer, wobei nur der 561-nm-Laser eingeschaltet ist. Stoppen Sie den Fluss und inkubieren Sie ihn 10 Minuten lang bei 37 °C.
   4. Schalten Sie den Durchfluss bei 0,4 ml/min ein, damit sich die DNA ausdehnen kann, und nehmen Sie Bilder in 2-s-Intervallen zwischen verschiedenen Frames auf, um Hochdurchsatzdaten der EWS-FLI1-Kondensatbildung zu erhalten.

2. Intensitätsanalyse für mCherry-EWS-FLI1

1. Importieren Sie die Daten als Bildsequenzen in die ImageJ-Software, wählen Sie die Punkte an 25× GGAA-Stellen in einem Quadrat von 8×8 Pixeln aus und speichern Sie das Bild in .tif Format.
2. Berechnen Sie die Intensität als Summe der Intensität im Quadrat von 8×8 Pixeln, einschließlich der gesamten Punktzahl, und entfernen Sie den Hintergrund, indem Sie die Intensität des Hintergrunds in einem Bereich derselben Größe in der Nähe des Quadrats von 8 x 8 Pixeln subtrahieren.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
488 nm diodengepumpter Festkörperlaser	kohärent	OBIS488LS
561 nm diodengepumpter Festkörperlaser	kohärent	OBIS561LS
Nikon Inverses Mikroskop	Nikon	Eclipse Ti
PMMA	PMMA	Prime95B