pH-Modulationsassay an gestützten Lipiddoppelschichten zum Nachweis von Protein-Phosphoinositid-Wechselwirkungen

Zusammenfassung

Quelle: Shengjuler, D., et al., PIP-on-a-chip: Eine markierungsfreie Studie zu Protein-Phosphoinositid-Wechselwirkungen. J. Vis. Exp. (2017)

In diesem Video demonstrieren wir Protein-Phosphoinositid-Wechselwirkungen in einem mikrofluidischen Muster unter Verwendung des pH-Modulationsassays unter Verwendung eines pH-empfindlichen Fluoreszenzfarbstoffs, der an das Phosphatidylethanolamin-Lipid einer unterstützten Lipiddoppelschicht, einer sogenannten mikrofluidischen Plattform, gebunden ist. Die Modulation des pH-Werts nach der Proteinbindung an Phospholipid führt zu einer Fluoreszenzlöschung.

Protokoll

>1. Bildung von unterstützten Lipid-Doppelschichten (SLBs)

1. 100 μl PI(4,5)P2-haltige SUVs werden in ein 0,65-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführt. Stellen Sie den pH-Wert der Lösung auf ~3,2 ein, indem Sie 6,4 μl 0,2 N Salzsäure hinzufügen.
   Anmerkung: Bestätigen Sie den pH-Wert der Lösung mit einem pH-Messgerät, das mit einer Mikro-pH-Sonde ausgestattet ist (siehe Materialtabelle).
2. Pipettieren Sie 10 μl der pH-eingestellten SUV-Lösung durch den Einlass in jeden Kanal und üben Sie mit der Pipette Druck aus, bis die Lösung den Auslass erreicht. Lösen Sie die Spitze von der Pipette und lassen Sie sie am Gerät befestigt.
3. Wiederholen Sie den obigen Schritt für jeden Kanal, und inkubieren Sie das Gerät dann 10 Minuten lang bei RT.
   Anmerkung: Die Injektion von Vesikeln in Mikrokanäle sollte unmittelbar nach der Montage des Geräts erfolgen.
4. Schneiden Sie Sätze von Zu- und Ablaufschläuchen mit einer Länge von jeweils 60 cm (Einlaufschlauch) bzw. 8 cm (Auslassschlauch) zu.
   Anmerkung: Durch das diagonale Schneiden des Schlauchs und das Erstellen einer scharfen Kante wird das Einführen des Schlauchs in die Ein- und Auslässe erleichtert. Der Auslassschlauch sollte eine Bogenform haben. Die Länge des Einlassschlauchs kann je nach Mikroskopkonfiguration variieren. Der Innendurchmesser des Schlauches beträgt 0,05 cm.
5. Verbinden Sie den Auslassschlauch mit einer Pinzette mit dem Gerät und kleben Sie das Gerät dann auf einen Mikroskoptisch.
6. Tauchen Sie ein Ende des Einlassschlauchsatzes in 25 ml Laufpuffer, der in einem konischen Schlauch enthalten ist, und kleben Sie ihn ab, um sicherzustellen, dass der Schlauch gesichert ist.
7. Stellen Sie das konische Röhrchen auf einen höheren Boden (~20 cm) als das Gerät, um die Lösung durch die Schwerkraft durch die Mikrokanäle zu drücken; dazu kann ein Laborheber verwendet werden.
8. Verwenden Sie für jeden Einlassschlauch eine Spritze, um 1 ml Laufpuffer aus dem freien Ende des Schlauchs zu ziehen. Entfernen Sie die Pipettenspitze aus dem Einlass und führen Sie das freie Ende des Einlaufschlauchs in das Gerät ein.
   Anmerkung: Geben Sie einen Tropfen Laufpuffer auf den Einlass, um die Wahrscheinlichkeit zu verringern, dass während dieses Schritts eine Luftblase in den Kanal eingebracht wird. Nachdem der Einlassschlauch am Gerät befestigt ist, verwenden Sie ein fusselfreies Tuch, um den überschüssigen Puffer zu entfernen.
9. Wiederholen Sie den obigen Schritt, um alle Einlassschlauchstücke mit dem Gerät zu verbinden.
   Anmerkung: Fließender Laufpuffer durch die Kanäle hilft, überschüssige Vesikel zu entfernen und die Doppelschicht an experimentelle Bedingungen anzupassen.
10. Öffnen Sie die Software zur Steuerung des Mikroskops (siehe Materialtabelle). Klicken Sie auf der linken Seite auf die Registerkarte "Mikroskop" und wählen Sie das "10X"-Objektiv.
11. Klicken Sie in der Symbolleiste auf die Bildsymbole "Live" und dann auf "Alexa 568". Fokussieren Sie sich mit den Fein- und Kurseinstellknöpfen auf die Mikrokanäle.
12. Scannen Sie das Gerät, um die Qualität der SLBs und der Kanäle zu überprüfen (Abbildung 1). Klicken Sie dann auf das Bildsymbol "FL Shutter Closed" in der Symbolleiste.
13. Klicken Sie auf die Registerkarte "Erfassung" und wählen Sie unter "Grundlegende Anpassungen" die Option "Belichtungszeit". Stellen Sie die Belichtungszeit auf "200 ms" ein.
14. Klicken Sie im linken Bereich auf "Multidimensionale Erfassung" und wählen Sie im Filtermenü den roten Kanal aus (gekennzeichnet als "Alexa 568"). Klicken Sie dann auf das Menü "Zeitraffer", stellen Sie das Zeitintervall auf 5 Minuten und die Dauer auf 30 Minuten ein und klicken Sie auf "Start".
    Anmerkung: Basierend auf der Dauer (30 min) und der Flussrate (~1,0 μL/min) werden 30 μl laufender Puffer verwendet, um den SLB innerhalb eines Kanals auszugleichen, d.h. 240 μl laufender Puffer werden für alle 8 Kanäle verwendet.
15. Wählen Sie das Werkzeug "Kreis" unter der Registerkarte "Messen" und zeichnen Sie einen Kreis in einem beliebigen Kanal. Klicken Sie mit der rechten Maustaste, während der Kreis ausgewählt ist, und wählen Sie "Eigenschaften". Aktivieren Sie auf der Registerkarte "Profil" die Option "Alle T", um die Fluoreszenzintensität als Funktion der Zeit anzuzeigen.
    1. Stellen Sie sicher, dass diese Kurve ein Plateau erreicht, das auf ein Gleichgewicht hinweist, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren.
16. Senken Sie die Pufferlösung auf die gleiche Masse wie die Vorrichtung ab, um den Durchfluss zu stoppen.
17. Speichern Sie die Zeitrafferdatei.

>2. Testen der Interaktion der PLC-δ1-PH-Domäne mit PI(4,5)P2-haltigen SLBs

1. Bereiten Sie Verdünnungen der PH-Domäne vor, indem Sie den Laufpuffer als Verdünnungsmittel verwenden.
   Anmerkung: Da das Gerät über acht Kanäle verfügt, sollten Sie mindestens zwei davon für leere Steuerelemente verwenden. Nehmen Sie die äußersten Enden auf jeder Seite und verwenden Sie die restlichen Kanäle für die Proteinverdünnung. Die folgenden PH-Domänenkonzentrationen wurden getestet: 0,10, 0,25, 0,50, 1,00 und 2,50 μM. Ungefähr 200 μl jeder Verdünnung reichten aus, um innerhalb von 30 Minuten ein Gleichgewicht zu erreichen.
2. Lösen Sie nacheinander jeden Auslassschlauch und geben Sie mit einer Pipette 200 μl jeder Proteinverdünnung in den Auslasskanal. Üben Sie keinen Druck aus, lassen Sie die Schwerkraft die Arbeit machen. Lösen Sie die Spitze von der Pipette und lassen Sie sie an der mikrofluidischen Vorrichtung befestigt.
3. Wiederholen Sie den obigen Schritt für jeden Kanal und stellen Sie sicher, dass während dieses Vorgangs keine Luftblasen in die Kanäle gelangen.
4. Senken Sie den Einlassschlauch auf einen Boden unterhalb des mikrofluidischen Geräts ab, um das Protein durch die Mikrokanäle zu fließen. Klebe das freie Ende des Schlauchs an einen Abfallbehälter. Lassen Sie die Proteinverdünnungen 30 min.
   Anmerkung: Dadurch wird der Fluss umgekehrt und das Protein kann in die Kanäle eingeführt werden. Die Zeit bis zur Äquilibrierung und das Volumen der benötigten Proteinverdünnungen hängen von der Affinität der Wechselwirkung ab.
5. Klicken Sie im linken Bereich der Software auf der Registerkarte "Zeitraffer" auf "Start", um das Bild erneut zu starten.
6. Wenn das Experiment abgeschlossen ist, speichern Sie die Zeitrafferdatei.

Ergebnisse

Abbildung 1: Bewertung der Integrität von SLBs und Mikrokanälen. (A) Ein Bild, das hochwertige SLBs und Mikrokanäle zeigt. (B) Unvollständige Verschmelzung. (C) Verschmolzene Mikrokanäle. (D) Staubpartikel, die in einem Mikrokanal eingeschlossen sind. (E) Luftblasen, die in Mikrokanälen eingeschlossen sind.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin	Avanti Polare Lipide	Artikel-Nr.: 850457C	POPC
L-α-phosphatidylinositol-4-phosphat	Avanti Polare Lipide	840045X	PI4P
L-α-Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat	Avanti Polare Lipide	840046X	PI(4,5)P2
1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin	Avanti Polare Lipide	850757C	Papst; Erforderlich für die Synthese von oSRB-POPE
Lissamin, Rhodamin, B, Sulfonylchlorid (gemischte Isomere)	ThermoFisher Scientific	L-20	Erforderlich für die Synthese von oSRB-POPE
pH-empfindliche fluoreszierende Lipidsonde (oSRB-POPE)	betriebseigen	N/A	Inhouse-Synthese (Huang D. et al. 2013)
Axiovert 200M Epifluoreszenzmikroskop	Carl Zeiss Mikroskopie	N/A	Mikroskop
AxioCam MRm Kamera	Carl Zeiss Mikroskopie	N/A	Kamera
X-Cite 120	Excelitas Technologies	N/A	Lichtquelle
Alexa 568 Filter-Set	Carl Zeiss Mikroskopie	N/A	Ex/Em 576/603 nm
AxioVision LE64 v.4.9.1.0 Software	Carl Zeiss Mikroskopie	N/A	Bildverarbeitungs-Software
tipps	VWR	Nr. 10034-132	200 μl Pipettenspitzen; Dünne und glatte Spitze zum Auftragen der Proteinlösung in den mikrofluidischen Kanal
tipps	VWR	Artikel-Nr.: 53509-070	10 μl Pipettenspitzen; Dünne und glatte Spitze zum Auftragen der Vesikellösung in den mikrofluidischen Kanal
Orion Star A321 pH-Messgerät	Thermo Scientific	STARA3210	pH-Messgerät
Orion Mikro-pH-Sonde	Thermo Scientific	8220BNWP	Mikro-pH-Sonde
N-(2-Hydroxyethyl)-piperazin-N'-(2-Ethalsulfonsäure)	VWR	VWRB30487	HEPES, Freie Säure
Natriumchlorid	VWR	BDH8014-2,5KGR	NaCl
Verrohrung	Allied Wire & Cable	TFT-200-24 N	Innendurchmesser: 0,051-0,066 cm (0,020-0,026 Zoll); Wandstärke: 0,025 cm (0,010 Zoll); Flexible dünnwandige Schläuche aus Polytetrafluorethylen; Natürliche Farbe
Stickstoffgas - Industrie	Praxair	N/A	Lokaler Anbieter
Sauerstoffgas - Industrie	Praxair	N/A	Lokaler Anbieter
Flüssigstickstoff	Praxair	N/A	Lokaler Anbieter