>1. Aufbau des Reagenzes und der Lösung
- Um ein vollständiges DMEM herzustellen, fügen Sie 5 ml L-Glutamin 200 mM, 5 ml Penicillin-Streptomycin 100x und 50 ml fötales Rinderserum (FBS, 10 % vol/vol Endkonzentration) zu 440 mL DMEM hinzu.
Anmerkung: Diese Lösung kann 1 Monat lang bei 4 °C gelagert werden.
- Bereiten Sie die Agaroselösung vor, indem Sie 150 mg niedrig gelierende Agarose in 10 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) bei 85 °C auflösen, um eine 1,5%ige (w/v) Lösung zu erhalten. Sterilisieren Sie durch Filtration mit einem 0,22 μm Filter. Bereiten Sie 1 ml Aliquots Agaroselösung in 1,5 N vor
- Bereiten Sie das Bioreaktormedium vor.
- 13,4 g DMEM-Pulver in 1 l hochreines H2O. auflösen
Anmerkung: Je nach Anwendung kann das erforderliche Endvolumen unterschiedlich sein (z. B. für 500 mL Medium 6,7 g Pulver in 500 mL H2O auflösen).
- Fügen Sie 2 % FBS, 10 mM NaHCO3, 1x Penicillin-Streptomycin (100x) und 2 % D2O hinzu (z. B. für 500 mL Medium fügen Sie 10 mL FBS, 0,4 g NaHCO3, 5 mL Penicillin-Streptomycin 100x und 10 mL D2O hinzu).
- Messen Sie den pH-Wert mit einem pH-Messgerät und stellen Sie ihn bei Bedarf durch Zugabe von HCl.
auf 7,4 ein
Anmerkung: Typischerweise liegt der anfängliche pH-Wert sehr nahe bei 7,4.
- Filtrieren Sie das Bioreaktormedium mit einem vakuumbetriebenen Sterilfilter in einer sterilen 250 mL oder 500 mL Glasflasche.
- Verschließen Sie die Flasche in der Laminar-Flow-Haube mit einem sterilen Stahlkopfstück mit zwei Schlauchtüllen und verbinden Sie sie mit einem FEP-Schlauch (ø = 1/8", i.d. = 1,6 mm), der an die Pumpe angeschlossen wird, und an einen 0,22 μm PTFE-Spritzenvorsatzfilter für die Luftansaugung.
>2. Aufbau des Bioreaktors
- Bauen Sie die Durchflusseinheit mit einem NMR-Schlauch der zweiten Durchflusseinheit zusammen, der später durch den Schlauch mit den Zellen ersetzt wird. Für die korrekte Montage ist die Bedienungsanleitung der Durchflusseinheit zu entnehmen.
Anmerkung: Zu diesem Zeitpunkt sollte die Durchflusseinheit bereits gereinigt sein (falls nicht, Schritt 4.2 durchführen).
- Stellen Sie das an die Durchflusseinheit angeschlossene Wasserbad auf 37 °C ein. Stellen Sie die Vorratsflasche in das Wasserbad.
- Verbinden Sie den FEP-Schlauch der Reservoirflasche mit der Pumpe.
- Drehen Sie das Bioreaktorventil auf "Bypass" und füllen Sie die Pumpe mit einem Medium vor.
- Drehen Sie das Bioreaktorventil auf "Durchfluss" und befüllen Sie den Bioreaktor mit dem Medium mit 0,1 mL/min.
>3. Vorbereitung der Zellprobe
- Entnehmen Sie die Zellen aus dem CO2 -Inkubator.
- Nehmen Sie einen T75-Kolben mit transfizierten HEK293T Zellen aus dem CO2 -Inkubator und entfernen Sie das verbrauchte Medium.
- Waschen Sie die Zellen zweimal mit 7 mL (jeweils) PBS bei Raumtemperatur (~20 °C).
- Verwenden Sie 2 ml Trypsin/EDTA, um Zellen abzulösen. Nach Zugabe der Lösung 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, um die Zellen zu lösen.
Anmerkung: Transfizierte Zellen können etwas länger brauchen, um sich abzulösen. Falls erforderlich, die Zellen bei 37 °C inkubieren.
- Inaktivieren Sie Trypsin mit 20 ml vollständigem DMEM; resuspendieren Sie die Zellen gründlich, indem Sie auf und ab pipettieren und sie in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen übertragen.
- Die Zellen werden bei 800 x g 5 min bei Raumtemperatur zentrifugiert und der Überstand verworfen.
- Waschen Sie die Zellen mit 10 mL PBS bei Raumtemperatur, um das Restmedium zu entfernen.
- Die Zellen werden bei 800 x g 5 min bei Raumtemperatur zentrifugiert und der Überstand verworfen.
- Übertragen Sie das Zellpellet in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit Deckel.
- Betten Sie Zellen in Agarosefäden ein.
- Ein Aliquot der erstarrten Agarose bei 85 °C im Wasserbad schmelzen und anschließend bei 37 °C in einem Blockheizer in Lösung halten.
- Füllen Sie mit einer Pasteurpipette den Boden des NMR-Röhrchens der Durchflusseinheit mit 60-70 μl 1,5 % Agarosegel und legen Sie es in Eis. Dadurch entsteht ein ~5 mm hoher Bodenstopfen, der es ermöglicht, die Zellprobe innerhalb des aktiven Volumens der 1-H-NMR-Spule zu platzieren.
- Das in Schritt 3.1.8 erhaltene Zellpellet wird bei 37 °C für 15-20 s im Thermoblock erhitzt.
- Die Zellen werden in 450 μl Agaroselösung resuspendiert. Achten Sie darauf, dass sich keine Blasen bilden.
- Aspirieren Sie die Zell-Agarose-Suspension in einen ~30 cm langen Chromatographie-PEEK-Schlauch (i.d. = 0,75 mm), der mit einer 1 mL-Spritze verbunden ist.
Anmerkung: Vor der Aspiration sollten der Schlauch und das Totvolumen der Spritze bei Raumtemperatur mit PBS vorgefüllt werden, um die Bildung von Blasen zu vermeiden. Die Länge des Schlauches ist unkritisch.
- Lassen Sie den Schlauch 2 min bei Raumtemperatur abkühlen.
- Füllen Sie das NMR-Röhrchen der Durchflusseinheit mit 100 μl PBS bei Raumtemperatur vor.
- Gießen Sie Fäden der in Agarose eingebetteten Zellen in den NMR-Schlauch der Durchflusseinheit, indem Sie die Spritze vorsichtig drücken.
Anmerkung: Um das NMR-Röhrchen gleichmäßig zu füllen, platzieren Sie zunächst das Ende des PEEK-Schlauchs an der Unterseite des NMR-Röhrchens und fahren Sie mit dem langsamen Schwingen von links nach rechts nach oben fort.
- Wiederholen Sie die Schritte 3.2.5, 3.2.6 und 3.2.8, bis die gesamte Zell-Agarose-Suspension gegossen wurde.
- Zellen in den Bioreaktor einsetzen.
- Entfernen Sie den leeren NMR-Schlauch aus der Durchflusseinheit und erhöhen Sie die Durchflussrate für einige Minuten auf 2 mL/min, um Restgasblasen im Einlassschlauch zu entfernen.
- Stellen Sie die Flussrate auf 0,2 mL/min ein und führen Sie den NMR-Schlauch mit den Zellen ein, indem Sie ihn langsam, aber stetig nach oben drücken.
Anmerkung: Durch die aktive Strömung des Mediums wird der Rückfluss von Rohrinhalt durch den Einlass vermieden, der sonst beim Einführen auftreten würde.
>4. Betrieb und Reinigung von Bioreaktoren
- Betrieb des Bioreaktors während des NMR-Experiments.
- Stellen Sie die Temperatur im NMR-Spektrometer auf 310 K ein.
- Setzen Sie die Durchflusseinheit in das Spektrometer ein.
- Das Bioreaktormedium wird während der gesamten Dauer der In-Zell-NMR-Experimente mit einer Flussrate von 0,1 ml/min zugeführt.
- Injizieren Sie zum gewünschten Zeitpunkt während des Versuchs eine konzentrierte Lösung des externen Moleküls in die Flasche des Mediumreservoirs, indem Sie den Silikonschlauch mit einer sterilen Langnadelspritze durchstechen.
Anmerkung: Die endgültige Konzentration des Moleküls im Medium sollte auf der Grundlage früherer Kenntnisse über die Zelltoxizität und, falls verfügbar, auf der vorhergesagten/geschätzten Diffusionsrate durch die Zellmembran gewählt werden.
- Ersetzen Sie am Ende des NMR-Experiments das Röhrchen mit den Zellen durch ein leeres Röhrchen und spülen Sie die Durchflusseinheit mit Wasser aus.
- Bioreaktor vor Ort reinigen.
- Reinigen Sie die Durchflusseinheit, indem Sie die folgenden Lösungen mit 1 ml/min fließen lassen: 0,2 M Natriumhydroxid (NaOH), 3 M Zitronensäure, 0,2 M NaOH für jeweils mindestens 30 Minuten, gefolgt von sterilgefiltertem Reinstwasser für >2 h.
- Reinigen und autoklavieren Sie die Reservoirflasche und die Schlauchbaugruppe nach jedem Lauf.
>5. NMR-Experimente
- Aufbau der NMR-Experimente.
Anmerkung: Führen Sie diese Schritte vor der Vorbereitung der In-Zell-NMR-Probe durch, um Verzögerungen zwischen der Zellentnahme und der Datenerfassung zu vermeiden.
- Legen Sie am NMR-Spektrometer einen neuen Datensatz an und stellen Sie die Parameter für die gewünschten NMR-Experimente ein.
- Legen Sie Parameter für 1D 1H NMR-Experimente fest.
- Zentrieren Sie die 1H-Trägerfrequenz bei 4,7 ppm auf dem Wassersignal.
- Wählen Sie das zgesgp-Pulsprogramm, stellen Sie die spektrale Breite auf 20 ppm und einen 1.000-μs-Rechteckimpuls mit 180° für die Wasserunterdrückung ein. Legen Sie eine Verzögerung zwischen den Scans von 1 s fest. Erfassen Sie das Spektrum mit 32 Scans.
- Für Zellen, die unmarkiertes CA II exprimieren: Wählen Sie das Pulsprogramm p3919gp, stellen Sie die spektrale Breite auf 30 ppm ein, um den Iminobereich des Spektrums abzudecken, und passen Sie die Verzögerung für die binomiale Wasserunterdrückung so an, dass die maximale Anregung bei den chemischen Verschiebungen der interessierenden Signale zentriert ist (d7 = 20 μs bei 950 MHz). Legen Sie eine Verzögerung zwischen den Scans von ≥1 s fest. Erfassen Sie mit 512 Scans.
- Für Zellen, die 15N-markiertes SOD1 exprimieren: Wählen Sie das Pulsprogramm sfhmqf3gpph, stellen Sie die Spektralbreiten von 1H und 15N auf 16 bzw. 50 ppm ein, den geformten Pulsversatz und die Anregungsbandbreite auf 8,5 bzw. 6 ppm und einen 350-μs-Impuls für das Entkopplungsschema (garp4 oder andere, je nach Gerät). Legen Sie eine Verzögerung zwischen den Scans von 0,3 s fest. Erfassen Sie 16 Scans und 128 Inkremente in der 15N-Dimension.
- Erfassung von NMR-Spektren in Echtzeit.
- Sobald der Bioreaktor in das NMR-Spektrometer eingesetzt ist, warten Sie einige Minuten, um den Austausch des Mediums zu ermöglichen.
Anmerkung: Dieser Vorgang lässt sich leicht anhand des Auftretens des Sperrsignals überwachen, da die PBS durch ein Medium mit 2 % D2O ersetzt wird.
- Passen Sie die Anpassung und Abstimmung des 1-H-Kanals an, unterlegen Sie den Magneten und berechnen Sie die harte Impulslänge von 1H 90°.
- Passen Sie die 1-Stunden-Leistung in jeder Impulssequenz entsprechend dem harten1-Stunden-Impuls an.
- Nehmen Sie ein erstes zgesgp 1H-Spektrum auf, um den Probengehalt und die Feldhomogenität zu überprüfen.
- Kopieren Sie die Experimente zgesgp und p3919gp/sfhmqcf3gpph in die gewünschte Anzahl und stellen Sie sie in die Warteschlange der Erfassungsspule.
ca: Die zgesgp-Spektren werden nur verwendet, um den Zustand der Probe und die Feldhomogenität zu kontrollieren; Daher können sie entweder übersprungen oder seltener aufgezeichnet werden.
- Für Zellen, die unmarkiertes CA II exprimieren: Verarbeiten Sie die p3919gp-Spektren durch Anwendung der Nullfüllung und der Exponentiallinienverbreiterungsfensterfunktion (LB = 20 Hz).
- Für Zellen, die 15N-markiertes SOD1 exprimieren: Verarbeiten Sie die sfhmqcf3gpph-Spektren durch Anwendung der Nullfüllung und der quadrierten Sinus-Glockenfenster-Funktion (SSB = 2) in beiden Dimensionen.
Anmerkung: Die Größe der bearbeiteten Spektren kann weiter reduziert werden, indem signalfreie Bereiche entfernt werden (in Topspin geschieht dies durch das Einstellen der gewünschten STSR- und STSI-Werte).
