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HINWEIS: Im Folgenden sind die Schritte für das Screening von T7-Phagen zur Wirkstofferkennung mit einem QCM-Biosensor und die Gewinnung der gescreenten Phagen über eine E. coli (BLT5615)-Infektion aufgeführt. Die Protokolle für die Synthese eines Derivats eines kleinen Moleküls, das eine selbstorganisierte Monoschicht (SAM) bildet, und für den Aufbau der T7-Phagen-gezeigten 15-mer-Zufallspeptidbibliothek finden Sie an anderer Stelle.
>1. Vorbereitung des QCM-Sensorchips
- Befestigen Sie einen keramischen Sensorchip an dem Oszillator eines 27-MHz-QCM-Geräts und zeichnen Sie die Eigenfrequenz (Hz) in der Luftphase auf, bevor kleine Moleküle immobilisiert werden.
- Trennen Sie den Chip und tropfen Sie mit einer Pipette 20 μl einer Lösung (1 mM in 70 % Ethanol) eines niedermolekularen Derivats, das SAM bildet, auf die Goldelektrode des Sensorchips.
Vorsicht: Der Sensorchip-Kristall, in dem sich die Goldelektrode (Au, 0,1 mm dick, 2,5 mm i.d., 4,9 mm2) befindet, ist extrem dünn und kann leicht reißen (SiO2, 0,06 mm dick, 9 mm i.d.). Pipettieren Sie daher vorsichtig.
- 1 h bei Raumtemperatur (ca. 20 °C) in einer Petrischale mit angefeuchtetem Tuch und vor Raumlicht geschützt aufbewahren.
- Waschen Sie die Elektrodenoberfläche vorsichtig mit Reinstwasser und entfernen Sie dann die Wassertropfen, indem Sie mit einer Spritze oder einem Staubwedel Luft blasen.
- Richten Sie den Sensorchip für das QCM-Gerät ein und zeichnen Sie die Frequenzreduzierung in der Luftphase auf, um die Menge des kleinen Moleküls zu messen, die immobilisiert wurde.
Anmerkung: Mindestens 100 Hz Eigenfrequenz sind für eine erfolgreiche Immobilisierung kleiner Moleküle erforderlich (1 Hz immobilisiert 30 pg).
>2. Biopanning der T7-Phagenbibliothek mit einem QCM-Biosensor (Abbildung 1)
- Setzen Sie eine Küvette mit einem speziellen Magnetrührer auf den QCM-Biosensor und gießen Sie 8 mL des Reaktionspuffers (10 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, pH 7-8) in die Küvette.
- Befestigen Sie den QCM-Sensorchip am Oszillator und ziehen Sie den Arm des Oszillators nach unten, um den Chip in den Puffer einzutauchen, der mit 1000 U/min gerührt wird.
- Starten Sie die Überwachung der QCM-Frequenz auf dem PC (PC) und warten Sie, bis das Sensorgramm auf etwa 3 Hz/min der Frequenzdrift abgestimmt ist.
- Injizieren Sie 8 μl einer T7-Phagenbibliothek (1-2 × 1010 pfu/ml) in die Küvette (Endkonzentration: 1-2 × 107 pfu/ml) und markieren Sie den Injektionspunkt auf dem Sensor.
- Überwachen Sie die Frequenzreduzierung, die durch die Bindung von T7-Phagen an das auf der Goldelektrodenoberfläche immobilisierte kleine Molekül für 10 Minuten verursacht wird.
- Stoppen Sie den QCM-Frequenzmonitor, lösen Sie den Sensorchip vom Oszillator und entfernen Sie den Puffer, indem Sie Luft blasen und/oder mit Tüchern ableiten.
- Legen Sie den Sensorchip in eine feuchte Petrischale und geben Sie die 20 μl der Suspension von E. coli (BLT5615) (OD600 = 0,5-1,0 nach dem Schütteln bei 37 °C durch Zugabe von IPTG zu 1 mM) Wirtszellen in der logarithmischen Phase auf die Goldelektrode.
- Schließen Sie den Deckel der Schüssel und decken Sie sie mit Alufolie ab, um das Licht abzuhalten.
- Inkubieren Sie die Schale 30 Minuten lang bei 37 °C auf einem 96-Well-Mikroplattenmischer (1000-1500 U/min), um die Rückgewinnung der gebundenen T7-Phagen zu verbessern.
- Die 20 μl der Lösung werden zurückgewonnen und in 200 μl LB-Medium suspendiert.
Anmerkung: Die in diesem Schritt gewonnenen Proben können eine Woche lang bei 4 °C konserviert werden.
- Bereiten Sie eine Verdünnungsserie der Phagenlösung für die Plaqueisolierung und DNA-Sequenzierung gemäß dem in den Anweisungen des Herstellers beschriebenen allgemeinen Verfahren vor.
