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>1. Vorbereitung des Systems
- Schließen Sie die MALS- und dRI-Detektoren nach dem UV-Detektor des FPLC an. Umgehen Sie die pH- und Leitfähigkeitsdetektoren, da sie das Volumen zwischen den Detektoren zwischen den UV- und MALS-Detektoren erheblich erhöhen. Verwenden Sie Kapillarschläuche mit einem Innendurchmesser von 0,25 mm von der Säule zu und zwischen den Detektoren und Kapillarschläuche mit einem Innendurchmesser von 0,75 mm am Ausgang der Detektoren zum Abfall- oder Fraktionssammler.
- Stellen Sie sicher, dass die erforderlichen Signalverbindungen zwischen dem FPLC und den Detektoren hergestellt wurden, einschließlich des Analogausgangs vom UV-Detektor zum MALS-Analogeingang und des digitalen Ausgangs vom FPLC zum MALS-Autoinject über die E/A-Box des FPLC
.
- Installieren Sie eine geeignete analytische SEC-Säule, die einen Fraktionierungsbereich von mindestens 20 kDa bis 500 kDa abdeckt. Überprüfen Sie die Produktinformationen, um festzustellen, ob die Säule für den Bereich von MW, pH und anderen Eigenschaften der Probe und der mobilen Phase geeignet ist.
>2. Vorbereitung des Puffers, Spülen des Systems über Nacht und Überprüfen der Sauberkeit
- Bereiten Sie unter Verwendung von Reagenzien in HPLC-Qualität 1 l phosphatgepufferte Kochsalzlösung mit 50-100 mM NaCl her. Filtern Sie den Puffer mit einem Polyethersulfonfilter oder ähnlichem auf 0,1 μm. Die ersten 50-100 ml Puffer in eine Abfallflasche filtrieren und entsorgen, um Partikel aus den Trockenfiltern zu entfernen, und dann den Rest in eine saubere, sterile Flasche filtern, die gründlich mit gefiltertem, entionisiertem Wasser gewaschen und verschlossen wurde, um das Eindringen von Staub zu verhindern.
Anmerkung: Andere Lösungsmittel der mobilen Phase, wie z. B. ein Tris-Puffer, können verwendet werden, wenn zusätzliche Proteine, die bevorzugt in diesen Lösungsmitteln gelöst sind, analysiert werden sollen.
- Über Nacht mit einer Durchflussrate von 0,5 ml/min spülen oder wie vom Säulenhersteller anderweitig empfohlen, um die Säule im Puffer auszugleichen und Partikel zu entfernen. Verwenden Sie den kontinuierlichen Flow-Modus des FPLC und stellen Sie sicher, dass der Flow nicht stoppt, bis alle SEC-MALS-Läufe abgeschlossen sind.
- Versetzen Sie die dRI-Durchflusszelle während der Spülung über Nacht in den Spülmodus. Deaktivieren Sie die Bereinigung, bevor Sie mit Beispielläufen beginnen.
- Zu Beginn der Spülung die Durchflussmenge schrittweise erhöhen, um den "Säulenabwurf"-Effekt (oder die Freisetzung von Partikeln) zu verhindern, der durch eine plötzliche Druckänderung in der Säule verursacht wird.
- Wenn bekannt ist, dass das System recht stabil und partikelfrei ist und sich im Gleichgewicht mit der gewünschten mobilen Phase befindet, ersetzen Sie die Nachtspülung durch eine kürzere Spülung von 2-3 Stunden.
- Überprüfen Sie die Sauberkeit des Systems, indem Sie leicht auf den Schlauch hinter der Säule klopfen, um angesammelte Partikel freizusetzen, und das Signal im 90°-Detektor auf dem Frontdisplay des MALS-Instruments beobachten. Stellen Sie sicher, dass das Spitze-Spitze-Rauschen nicht mehr als 50 -100 μV beträgt.
- Führen Sie eine "leere" Injektion durch, um zu überprüfen, ob der Injektor frei von Partikeln ist. Ein "Rohling" ist einfach der laufende Puffer, der in einem frischen, sterilen Fläschchen zubereitet wird.
- Wenn der Partikelpeak nicht mehr als 1 ml Volumen und nicht mehr als 5 mV über dem Ausgangswert liegt, ist das System bereit für Proben. Andernfalls führen Sie zusätzliche Blindinjektionen durch, bis sie sauber sind, oder führen Sie Wartungsarbeiten durch, um den Injektor zu reinigen.
>3. Vorbereiten und Laden der Probe
- Bereiten Sie mindestens 200 μl BSA mit 1-2 mg/ml im SEC-Puffer vor.
Anmerkung: Um Ausfällungen zu vermeiden, sollte BSA niemals in reinem Wasser gelöst werden.
- Filtern Sie das Protein mit einem Spritzenspitzenfilter auf 0,02 μm.
- Entsorgen Sie die ersten Tropfen Filtrat, um Partikel aus den Trockenfiltern zu entfernen.
- Alternativ können Sie die Probe 15 Minuten lang bei 10.000 x g zentrifugieren, um die Ausfällung von unlöslichen Aggregaten und anderen großen Partikeln zu ermöglichen.
- Injizieren Sie 100 μl der BSA-Lösung in die Schleife.
Anmerkung: Dies ist die empfohlene Materialmenge, die je nach den Umständen der Probe, wie z. B. Stabilität oder Verfügbarkeit, mehr oder weniger injiziert werden kann. Die pro Injektion erforderliche Proteinmenge variiert umgekehrt mit dem Molekulargewicht: Bei einem Molekulargewicht von 33 kDa oder der Hälfte des Molekulargewichts von BSA wird die doppelte Proteinmasse benötigt.
4. Vorbereitung der MALS-Software
- Öffnen Neu | Experimentieren Sie mit Methode im Menü der MALS-Software und wählen Sie die Online-Methode aus dem Methodenordner des Lichtstreusystems. Wenn ein DLS-Detektor vorhanden ist, wählen Sie die Methode Online aus dem Feld Lichtstreuung | Mit QELS-Ordner.
- Legen Sie im Abschnitt Konfiguration die Parameter für die Proben- und Mobilphase fest.
- Legen Sie in der Ansicht "Generische Pumpe" die Durchflussmenge auf die im FPLC verwendete Durchflussmenge fest.
- Wählen Sie in der Ansicht "Generische Pumpe" im Feld "Lösungsmittelzweig" im Feld "Name" die Option "PBS" aus.
- Geben Sie in der Ansicht Injektor im Zweig Probe den Namen als BSA ein, und legen Sie dn/dc = 0,185 (den Standardwert für unmodifizierte Proteine), A2 = 0 und den UV-Extinktionskoeffizienten = 0,667 ml/(mg-cm) fest
Anmerkung: Für andere Proteine kann der Extinktionskoeffizient vonUV 280 nm in der Literatur gefunden oder aus seiner Sequenz mit verschiedenen gemeinfreien Softwaretools berechnet werden.
- Aktivieren Sie im Abschnitt Prozeduren in der Ansicht Basic Collection das Kontrollkästchen Trigger on Autoinject und legen Sie die Dauer des Laufs auf 70 Minuten fest, sodass Daten für die gesamte Elution gesammelt werden, bis das Gesamtpermeationsvolumen der SEC-Spalte erreicht ist.
Anmerkung: Die erforderliche Zeit kann je nach Säule und Flussrate variieren - 35 Minuten der Entnahme sind für eine Standard-HPLC-SEC-Säule von 7,8 mm x 300 mm bei 0,5 mL/min erforderlich.
- Starten Sie das Experiment in der MALS-Software, indem Sie auf die Schaltfläche Ausführen klicken. Er beginnt mit dem Lesen der Daten, nachdem er das Pulssignal vom FPLC-Instrument über den MALS-Detektor empfangen hat.
- Stellen Sie das dRI-Signal auf Null, indem Sie auf die Schaltfläche Autozero auf der Vorderseite des Geräts klicken.
>5. Vorbereitung der FPLC-Software
- Geben Sie den Namen des Proteins und den Lauf in der FPLC-Software in das Feld Manuell | Ausführen manueller Anweisungen | Markierung setzen.
- Schalten Sie das Einspritzventil unter Strömungsweg von manueller Belastung auf Einspritzen um | Einspritzventil.
- Fügen Sie ein Impulssignal hinzu, indem Sie einen 0,5 s-Impuls unter die E/A-Box einfügen | Pulsieren Sie digital aus. Dadurch wird die Datenerfassung in der MALS-Software ausgelöst.
>6. Injiziere das Sample in die Schleife. Klicken Sie in der FPLC-Software auf Ausführen, um den Experimentlauf zu starten.