>1. Probenvorbereitung
- Reinigen Sie das gewünschte Biomolekül.
Anmerkung: Dieses Protokoll verwendet gekauftes kokainbindendes DNA-Aptamer MN4 nach dreimaligem Austausch gegen 2 M NaCl, gefolgt von drei Runden deionisiertem Wasser unter Verwendung eines Zentrifugalfilters mit einer 3 kDa Molekulargewichts-Cut-off-Membran.
- Synthetisieren und reinigen oder kaufen Sie den gewünschten thermolabilen Liganden.
Anmerkung: MN4 bindet den thermolabilen Liganden Kokain. MN4 bindet auch Chinin, das als Negativkontrolle für die Ligandenthermolabilität bei diesen experimentellen Temperaturen verwendet wird.
- Bereiten Sie Puffer für die Dialyse des gereinigten Biomoleküls und die Auflösung von Liganden vor (20 mM Natriumphosphat und 140 mM NaCl-Puffer, pH 7,4, für MN4 und die hier verwendeten Liganden).
- Dialysieren Sie das Biomolekül gegen mindestens 2 l des Puffers mit einem Dialyseschlauch mit einem Cut-off von 0,5 - 1,0 kDa.
- Filtrieren Sie den Endpuffer (den sogenannten Arbeitspuffer) durch einen 0,2-μm-Filter, der gründlich mit dem Puffer ausgeglichen wurde.
- Wiegen Sie die gewünschten Massen der Liganden ab und lösen Sie sie in einem gefilterten Arbeitspuffer auf. Wenn die gewünschten Ligandenkonzentrationen Massen erfordern, die zu klein sind, um sie genau zu wiegen, stellen Sie eine konzentrierte Ligandenstammlösung her (z. B. 10x).
Anmerkung: Es ist wichtig, dass alle DSC-Experimente denselben Arbeitspuffer für die Probe und den Liganden verwenden, d. h. niemals ein Experiment durchführen, bei dem der Ligand in einer anderen Charge von Arbeitspuffern als das Biomolekül gelöst wird, da dies zu Puffer-Mismatch-Artefakten in den Daten führt.
- Die Biomolekül-Stammlösung wird durch einen 0,2-μm-Filter filtriert, der gründlich mit dem Arbeitspuffer äquilibriert wurde.
- Bestimmung der Biomolekülkonzentration durch Absorptionsmessungen (260 nm für Nukleinsäuren wie MN4 und 280 nm für Proteine).
- Lagern Sie das vorbereitete Biomolekül und den Liganden in einem 4 °C-Kühlschrank (geeignet für MN4 und die hier verwendeten Liganden) oder bei -20 oder -80 °C, wenn das Biomolekül und die Liganden ein Einfrieren vertragen und eine Langzeitlagerung erforderlich ist. Entgasen Sie den Puffer, das Biomolekül und die Ligandenlösungen in einem Tischentgaser (siehe Materialtabelle), bevor Sie sie in den DSC laden.
Anmerkung: Die Entgasung hilft, die Blasenbildung in der DSC bei höheren Temperaturen zu verhindern. Blasen verursachen Signalartefakte, die die DSC-Peakformen und Basislinien verdecken.
>2. DSC-Vorbereitung
- Schrauben Sie den Druckgriff vom DSC ab (siehe Werkstofftabelle).
- Führen Sie den Silikonschlauch aus dem Arbeitspuffer und befestigen Sie ihn am vorderen Flansch (Metallöffnung) der Referenzkapillare.
- Erstellen Sie eine Brücke zwischen der Referenz- und der Probenkapillare, indem Sie den hinteren Referenzflansch mit dem vorderen Probenflansch verbinden.
- Befestigen Sie ein Stück Silikonschlauch am hinteren Probenflansch, der zu einem Abfallkolben führt, an den eine Vakuumleitung angeschlossen ist.
- Schalten Sie die Vakuumleitung ein, um den DSC mit 200 mL Arbeitspuffer zu spülen.
- Laden Sie die Referenzkapillare des DSC mit dem Arbeitspuffer. Befestigen Sie ca. 3 - 5 cm lange Abschnitte des Silikonschlauchs an den Referenzkapillarflanschen.
- Führen Sie eine 1-ml-Pipettenspitze in den Silikonschlauch des hinteren Flansches ein. Ziehen Sie 0,8 ml Arbeitspuffer mit einer Pipette und führen Sie die Pipettenspitze mit Puffer in den Silikonschlauch des vorderen Referenzflansches ein.
- Drücken Sie den Pipettenkolben vorsichtig nach unten, um den Arbeitspuffer durch den vorderen Silikonschlauch in die Referenzkapillare und nach oben in die am hinteren Flansch angebrachte Pipettenspitze zu führen. Drücken Sie den Pipettenkolben nach unten, bis der Arbeitspuffer knapp über dem vorderen Silikonschlauch liegt, und lassen Sie dann den Pipettenkolben los, bis der Arbeitspufferspiegel knapp über dem hinteren Silikonschlauch liegt.
- Wiederholen Sie den Vorgang und führen Sie den Arbeitspuffer hin und her, um das Volumen in der Referenzkapillare von Blasen zu reinigen.
Anmerkung: In der Regel reichen 10 Durchgänge der Lösung hin und her aus, um eventuelle Blasen zu entfernen.
- Verschließen Sie die hintere Pipettenspitze mit dem Daumen und ziehen Sie sie vorsichtig an der hinteren Pipettenspitze und der vorderen Pipette nach oben, um sie mit dem angebrachten Silikonschlauch aus den Referenzflanschen zu entfernen.
- Laden Sie die Probenkapillare mit dem Arbeitspuffer wie in den Schritten 2.6 - 2.9. Setzen Sie eine schwarze Kunststoffkappe auf die hinteren Referenz- und Probenflansche, so dass die vorderen Flansche nicht abgedeckt sind.
- Bringen Sie den Druckgriff an.
- Öffnen Sie die DSC-Software (siehe Materialtabelle) und setzen Sie das Gerät unter Druck, indem Sie auf den roten Aufwärtspfeil oben auf der Benutzeroberfläche klicken, sobald sich der Leistungsmesswert stabilisiert hat. Die DSC-Leistung wird in einem Feld oben rechts auf der Benutzeroberfläche zusammen mit dem Temperatur- und Druckmesswert des Geräts angezeigt.
Anmerkung: Überwachen Sie den Leistungsmesswert, während der DSC unter Druck gesetzt wird. Änderungen der Leistung von mehr als ~ 10 μW deuten auf Blasenbildung in den Kapillaren hin, die zu Artefakten in den Daten führen können. Die Lösungen müssen entfernt und weiter entgast werden, bevor Sie fortfahren können.
- Äquilibrieren Sie den DSC mit dem Arbeitspuffer, indem Sie einen Vorwärts- und Rückwärtsscan durchführen. Stellen Sie sicher, dass auf der Registerkarte "Experimentelle Methode" auf der linken Seite des Bildschirms die Option "Scannen" ausgewählt ist, um den DSC im Temperaturscanmodus auszuführen.
Anmerkung: Experimentelle Parameter sind der Scanbereich der Temperatur, die Scanrate, die Äquilibrierungszeit bei niedrigen und hohen Temperaturen und die Anzahl der Scans.
- Klicken Sie im Einschub "Temperaturparameter" unter dem Reiter "Experimentelle Methode" auf die Schaltfläche für "Heizen". Geben Sie 1 und 100 °C für die untere und obere Versuchstemperatur, 1 °C/min für die Abtastrate und 60 s für die Äquilibrierungsperiode ein.
- Klicken Sie auf den Button "Serie hinzufügen" unter dem Eingabefeld für den Ausgleichszeitraum. Geben Sie 2 in das Feld "Schritte zum Hinzufügen" im Popup-Fenster ein (für einen Heiz- und einen Kühlscan) und aktivieren Sie das Kontrollkästchen "Alternatives Heizen/Kühlen". Klicken Sie auf "OK"; Die hinzugefügten Scans werden im unteren Teil der Benutzeroberfläche angezeigt. Überprüfen Sie, ob die Parameter für jeden Scan wie gewünscht sind.
- Starten Sie das Experiment, indem Sie auf die grüne Schaltfläche "Play" oben auf der Benutzeroberfläche klicken. Navigieren Sie zum gewünschten Ordner und geben Sie im Popup-Fenster einen Dateinamen zum Speichern des Experiments ein. Zeigen Sie den Fortschritt des Experiments an, indem Sie auf die Registerkarte "Daten" rechts neben der Registerkarte "Experimentmethode" klicken.
>3. Sammeln von DSC-Datensätzen für thermolabile Liganden
HINWEIS: Das minimale Verfahren besteht aus fünf Experimenten: Pufferreferenzexperimente mit und ohne Liganden (wird für die Basisliniensubtraktion verwendet), Probenexperimente mit dem freien Biomolekül, dem ligandengebundenen Biomolekül und dem ligandengebundenen Biomolekül mit einer längeren Hochtemperatur-Gleichgewichtsperiode.
- Führen Sie Referenzexperimente für die Basisliniensubtraktion der Beispieldaten durch. Laden Sie den DSC mit dem Arbeitspuffer in beide Kapillaren und sammeln Sie mehrere Vorwärts- und Rückwärtsscans über einen geeigneten Temperaturbereich bei 1 °C min-1 mit einer oberen (Hochtemperatur-)Äquilibrierungszeit von 120 s.
- Löschen Sie die vorherigen Puffer-Äquilibrierungsscans aus dem unteren Teil der Schnittstelle, indem Sie jeden einzelnen markieren und auf das rote X in der Mitte rechts in der Benutzeroberfläche klicken. Fügen Sie die neuen Scans hinzu, indem Sie auf die Schaltfläche "Serie hinzufügen" klicken, die Zahl 20 in das Feld für "Hinzuzufügende Schritte" eingeben und das Kontrollkästchen "Alternatives Heizen/Kühlen" aktivieren. Klicken Sie auf OK, und führen Sie das Experiment aus, indem Sie auf die grüne Wiedergabeschaltfläche wie oben klicken.
- Die Schritte 3.1 - 3.1.1 werden mit dem Arbeitspuffer wiederholt, der die gewünschte Ligandenkonzentration in beiden Kapillaren enthält, um die Referenzversuche für den Liganden zu erhalten (es werden zwei separate Experimente mit 120 s bzw. 600 s Hochtemperatur-Äquilibrierungszeiten durchgeführt, die zur Ermittlung der Geschwindigkeitskonstante für die thermolabile Ligandenumwandlung verwendet werden).
Anmerkung: Die hier verwendete Abtastrate stellt sicher, dass sich das Biomolekül in den nachfolgenden Experimenten im Vor- und Rückwärts-Scan im thermischen Gleichgewicht befindet. Scanraten < 0,1 - 0,2 °C min-1 führen zu verrauschten Thermogrammen und sind in DSC-Experimenten nicht anwendbar. Die Temperaturen sollten von deutlich unter der Schmelztemperatur des freien Biomoleküls bis weit über die Schmelztemperatur des ligandengesättigten Biomoleküls reichen (~ 20 - 80 °C für MN4). Überprüfen Sie die Reproduzierbarkeit der Scans (z. B. sind 10 Vorwärts- und 10 Rückwärtsscans für insgesamt 20 ausreichend).
- Wenn Sie mehrere Liganden (wie Kokain und Chinin) verwenden, spülen Sie den DSC zwischen den Durchläufen mit 200 ml Arbeitspuffer (wiederholen Sie dies ab Schritt 2.5), um Liganden aus den Kapillaren zu entfernen und eine Kreuzkontamination zu verhindern.
Anmerkung: Es ist hilfreich, nach einem ligandengebundenen Lauf ein Replikationsexperiment am freien Biomolekül durchzuführen, um zu überprüfen, ob der vorherige Ligand stark an den Kapillarwänden adsorbiert und nicht ausreichend durch Pufferspülung entfernt wird. Wenn die Thermogramme für das freie Biomolekül nach dem ligandengebundenen Experiment auf eine größere Größe und eine höhere Denaturierungstemperatur verschoben zu sein scheinen, ist es wahrscheinlich, dass der vorherige Ligand nach dem Spülen noch im Kalorimeter vorhanden ist. Entfernen Sie den adsorbierten Liganden, indem Sie die Kapillaren 1 h lang bei 60 °C mit 20 % Contrad-70 inkubieren, wobei die Kunststoffkappen und der Druckgriff abgenommen werden. Ändern Sie in der DSC-Software den experimentellen Modus auf der Registerkarte Experimentelle Methode in "Isotherm". Wählen Sie 3.600 s für die Dauer und 60 °C für die isotherme Temperatur, wobei Null für die Äquilibrierungszeit eingegeben wird. Klicken Sie auf "Zur experimentellen Methode hinzufügen". Das isotherme Experiment wird im unteren Teil des Bildschirms angezeigt. Spülen Sie das Gerät nach Abschluss mit 2 l entionisiertem Wasser und wiederholen Sie den Vorgang ab Schritt 2.5.
- Führen Sie Beispielexperimente mit dem gleichen DSC-Ladeverfahren und den gleichen experimentellen Parametern wie die Referenzscans durch. Stellen Sie für den Datensatz der freien Biomoleküle sicher, dass die Referenzkapillare den Arbeitspuffer enthält, während die Probenkapillare das freie Biomolekül in der gewünschten Konzentration im Arbeitspuffer enthält.
- Stellen Sie bei den ligandengebundenen Experimenten sicher, dass sich der Ligand im Arbeitspuffer in der Referenzkapillare befindet und das Biomolekül plus Ligand sich im Arbeitspuffer in der Probenkapillare befindet. Spülen Sie das System zwischen den Additionen verschiedener Liganden, wie in Schritt 2.5 beschrieben.
- Führen Sie ein zusätzliches Experiment mit dem Biomolekül durch, das an den thermolabilen Liganden gebunden ist, wobei die Hochtemperatur-Gleichgewichtsperiode auf 600 s erhöht wird und alle anderen experimentellen Parameter die gleichen sind wie in Schritt 3.2.1.
Anmerkung: Die Dauer der Hochtemperatur-Gleichgewichtsperiode für das zweite ligandengebundene Experiment wird einfach so gewählt, dass der Ligand schneller erschöpft wird als beim Experiment mit kurzer Äquilibrierungszeit. Wenn die ligandengebundenen Peaks aus dem ersten Experiment in Abhängigkeit von der Scanzahl langsam abklingen (z. B. betragen die Unterschiede in den aufeinanderfolgenden Peakmaxima ≤ 0,5 °C), schätzen Sie einen 10- bis 20-fachen Anstieg in der Hochtemperatur-Gleichgewichtsperiode, um den Liganden während des zweiten Experiments angemessen zu erschöpfen. Die genaue Berechnung der Geschwindigkeitskonstante für die Ligandenumwandlung erfordert, dass das zweite Experiment eine schnellere Erschöpfung des Liganden im Vergleich zum ersten aufweist. Die Ligandenkonzentrationen, die aus der globalen Analyse der beiden Experimente extrahiert wurden, werden ähnlich sein und daher unbrauchbar sein, wenn der Ligandenabbau im zweiten Experiment nicht ausreichend beschleunigt wird.
>4. Datenverarbeitung
- Öffnen Sie die DSC-Experimentdateien in der DSC-Datenanalysesoftware (siehe Materialtabelle) und exportieren Sie die Rohleistungsdaten als Tabellenkalkulation.
- Importieren Sie die Tabellenkalkulationen mit den Rohleistungsdaten in eine Software zur Datenanpassung.
- Subtrahieren Sie die Probendaten, indem Sie die Pufferleistungsdaten von den Experimenten mit freien und ligandengebundenen Biomolekülen subtrahieren.
Anmerkung: Für das thermolabile Ligandenexperiment nimmt die Konzentration des Ausgangsliganden mit jedem Scan ab. Daher ist es ideal, den Pufferscan 1 von der Probenscan 1 zu subtrahieren usw. Wir haben festgestellt, dass sich die Pufferscans mit Kokain im Laufe der Ligandenumwandlung nicht nennenswert verändern und daher ein einziger thermolabiler Ligandenpuffer-Scan verwendet werden kann, um alle thermolabilen ligandengebundenen Daten zu subtrahieren.
- Konvertieren Sie die subtrahierten Leistungsdaten der Basislinie in die Wärmekapazität.
Anmerkung: Für die Umwandlung wird das partielle spezifische Volumen des Biomoleküls benötigt, das abgeschätzt werden kann.
>5. Datenanalyse
- Globale Anpassung des Datensatzes zur thermolabilen ligandengebundenen Wärmekapazität mit kurzer Äquilibrierungszeit mit einem einzigen Satz von Baseline-, Ligandenkonzentrations-, Faltungs- und Ligandenbindungsparametern.
- Wiederholen Sie die globale Anpassung für das Dataset mit langer Äquilibrierungszeit, um die Geschwindigkeitskonstante für die Umwandlung thermolabiler Liganden zu berechnen.
