$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
>1. Vorbereitung von CXCL12-, Assay-Puffer- und Jurkat-Zellen für den Konkurrenzbindungsassay
- Eine Stammlösung von CXCL12AF647 (20 μg/ml; siehe Tabelle der Materialien und Reagenzien) wird hergestellt, indem das lyophilisierte Reagenz (gelagert bei -80 °C, im Dunkeln) in Reinstwasser gelöst und mit 0,01 % (Volumen/Volumen) Polysorbat 20 ergänzt wird. Lagern Sie Einmal-Aliquots aus dieser Stammlösung bei -80 °C vor Licht geschützt.
- Bereiten Sie den Assay-Puffer vor, indem Sie 40 mL HEPES (1 M, 20 mM Endkonzentration) zu 200 mL Hank's Balanced Salt Solution (HBSS, 10x, ohne Phenolrot und ohne Natriumbicarbonat, 1x Endkonzentration) hinzufügen. Reinstwasser hinzufügen, um ein Endvolumen von 2 l zu erhalten. 4 g (0,2 % Gew./Volumen) Rinderserumalbumin (BSA) zugeben und das BSA durch magnetisches Rühren auflösen. Zum Schluss stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 ein (verwenden Sie dazu NaOH) und filtrieren Sie die Lösung mit einem Vakuumverteiler durch 0,2 μm Poren (siehe Tabelle der Materialien und Reagenzien).
HINWEIS: Dieser Assay-Puffer wird in allen weiteren Schritten des Protokolls verwendet.
- Zählen Sie die Anzahl und die Lebensfähigkeit der Jurkat-Zellen. Entnehmen Sie dazu eine Probe der Zellsuspension und verdünnen Sie diese in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
Anmerkung: Wir verwenden routinemäßig einen automatisierten Zellviabilitätsanalysator (siehe Tabelle der Materialien und Reagenzien), der in der Lage ist, Zellsuspensionen in unterschiedlichen Konzentrationen zu zählen. Für die Zellzählung verdünnen Sie 0,5 mL Zellsuspension in 1,5 mL PBS (andere Verdünnungen, z. B. 0,1 mL in 1,9 mL PBS, sind ebenfalls möglich). Es gibt mehrere andere im Handel erhältliche Geräte zum Zählen von Zellzahlen und Lebensfähigkeit, die ebenso gut funktionieren sollten.
- Sammeln Sie die gewünschte Anzahl von Zellen (d. h. ~24 x 106 Zellen, um den Assay mit einer vollständigen 96-Well-Platte durchzuführen) in einem sterilen 50-ml-Röhrchen durch Zentrifugation (siehe Tabelle der Materialien und Reagenzien für den verwendeten Zentrifugentyp) bei 400 x g für 5 Minuten bei RT.
- Gießen Sie den Überstand vorsichtig ab, ohne das Zellpellet zu stören. Fügen Sie frischen Assay-Puffer (z. B. 20 ml) hinzu und resuspendieren Sie die Zellen durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren.
- Zentrifugieren Sie die Zellen erneut bei 400 x g für 5 min bei RT.
- Gießen Sie den Überstand wieder ab und resuspendieren Sie das Zellpellet in frischem Assay-Puffer, um eine Dichte von 5 x 106 Zellen/ml zu erhalten.
>2. Wettkampf-Bindungs-Assay
HINWEIS: Der eigentliche Wettkampfbindungsassay wird bei RT durchgeführt und kann unter unsterilen Bedingungen durchgeführt werden.
- Die zu untersuchenden Verbindungen werden in einem Assay-Puffer (siehe 1.2) verdünnt, um die gewünschte Konzentration zu erhalten. Bereiten Sie entweder eine feste Konzentration der Verbindung für das erste Screening vor (z. B. 10 μM Endkonzentration) oder alternativ eine serielle Verdünnungsreihe von Konzentrationen für eine detailliertere Charakterisierung der Verbindungen (z. B. eine 1/3-, 1/4- oder 1/5-Verdünnungsreihe ab 1 μM, Endkonzentration). Denken Sie daran, dass die Verbindungslösung im Assay letztendlich 2x verdünnt wird; Bereiten Sie daher eine 2x konzentrierte Lösung vor.
- 100 μl Verbundlösung (2x konzentriert) in eine durchsichtige runde 96-Well-Bodenplatte (siehe Tabelle der Materialien und Reagenzien) gemäß einem vordefinierten Versuchslayout (z. B. Abbildung 1C) dosieren.
HINWEIS: In diesem Stadium werden Negativ- und Positivkontrollproben in den Assay einbezogen. In der Negativkontrollprobe werden 100 μl Assay-Puffer anstelle der Verbindung in die Vertiefungen der 96-Well-Platte gegeben. Für die Positivkontrollprobe wird in diesem Schritt auch ein Assay-Puffer zugegeben. Siehe auch Abbildung 1C für einen typischen Versuchsaufbau, in dem eine Verdünnungsreihe mehrerer Verbindungen getestet wird.
- 50 μl Zellsuspension (siehe 1.7; 0,25 x 106 Zellen) aus einem Reagenzreservoir werden mit einer Mehrkanalpipette in die 96-Well-Platte gegeben. Inkubieren Sie die Platte 15 Minuten lang bei RT im Dunkeln.
- Geben Sie 50 μl fluoreszenzmarkiertes CXCL12 (d. h. 100 ng/ml CXCL12AF647 in Assay-Puffer, 4x konzentriert, 25 ng/ml, Endkonzentration) aus einem ähnlichen Reagenzreservoir in die Vertiefungen der 96-Well-Platte. 30 min bei RT im Dunkeln inkubieren.
Anmerkung: Bei den Negativkontrollproben wird stattdessen Assay-Puffer zugegeben. Daher entspricht das in den negativen Kontrollproben detektierte Fluoreszenzsignal dem autofluoreszierenden Hintergrundsignal (Abbildung 1A). Für die Positivkontrollproben werden 50 μl/VertiefungCXCL12 AF647 zugegeben. Die positiven Kontrollproben liefern das maximal nachgewiesene Fluoreszenzsignal, da keine potenzielle Hemmung durch Vorinkubation mit Verbindungen enthalten war (Abbildung 1A).
- Die 96-Well-Platte wird bei 400 x g 5 Minuten lang bei RT zentrifugiert. Entfernen Sie den Überstand aus den pelletierten Zellen, indem Sie die Platte umdrehen. Trocknen Sie die Platte auf einem Taschentuch.
- Geben Sie 200 μl frischen Assay-Puffer aus einem Reagenzreservoir mit einer Mehrkanalpipette in die Wells. Fahren Sie sofort fort.
- Die Platte erneut 5 min bei 400 x g bei RT zentrifugieren. Den Überstand durch Umdrehen der Platte entfernen und erneut auf einem Taschentuch trocknen.
- Resuspendieren Sie das Zellpellet vorsichtig in 200 μl 1 % Paraformaldehyd, gelöst in PBS. In diesem Schritt werden die Zellen fixiert.
- Setzen Sie das Protokoll sofort mit der Quantifizierung der Fluoreszenz durch Durchflusszytometrie fort.
>3. Analyse der Proben mittels Durchflusszytometrie
CXCL12AF647 gefärbte und fixierte Zellen sind nun bereit für die Analyse mittels Durchflusszytometrie. Es können verschiedene Arten von Durchflusszytometern verwendet werden, aber sie müssen mit dem richtigen Laser (d. h. einem roten Laser, Anregungsbereich ~630 nm) für die Anregung und geeigneten Filtern für die Fluorophordetektion (Emissionsfilter ~660 nm) ausgestattet sein. Sie müssen in der Lage sein, Proben in einem 96-Well-Plattenformat zu verarbeiten. Beispiele für geeignete Durchflusszytometrie-Geräte sind in der Tabelle der Materialien und Reagenzien aufgeführt.
- Starten Sie das Gerät und öffnen Sie die entsprechende Software (siehe Tabelle der Materialien und Reagenzien).
- Wählen Sie die folgenden zellularen Parameter aus, die in einem Dot-Blot-Format visualisiert werden sollen: Vorwärtsstreuung (FSC), Seitenstreuung (SSC) und der Fluorophor-Detektionskanal (CXCL12AF647).
Anmerkung: Mit dem FSC-Parameter werden Zellen anhand ihrer Größe diskriminiert, da die detektierte Lichtabsorption proportional zum Durchmesser der Zelle ist. Der SSC-Parameter, der die Lichtstreuung in einem 90°-Winkel misst, gibt Aufschluss über die Granularität der Zellen.
- Wählen Sie eine Probe (z. B. eine negative Kontrollprobe), um das Gating einer definierten homogenen Zellpopulation basierend auf den FSC- und SSC-Parametern durchzuführen.
- Wählen Sie die automatische Injektion von ~100 μl fixierten Zellen aus dieser negativen Kontrollprobe in das Durchflusszytometer. Wählen Sie die Option "Mischen" vor der Injektion und verwenden Sie eine Probenflussrate von 1,5 μL/s.
- Führen Sie dieses Beispiel aus, indem Sie "Daten erfassen" auswählen. Die FSC- und SSC-Parameter für dieses Beispiel werden nun auf dem Bildschirm angezeigt.
- Wählen Sie das Gating-Tool der Software aus. Basierend auf der FSC- und SSC-Dot-Blot-Visualisierung können Sie eine homogene und lebensfähige Zellpopulation durch Gating vordefinieren. Erstellen Sie dazu ein Polygon (mit dem Gating-Tool der Software), das die homogen verteilten Einzelzellen ("Ereignisse") basierend auf diesen beiden Dimensionen enthält.
Anmerkung: Das Gating-Verfahren zielt darauf ab, eine homogene und lebensfähige Zellpopulation zu definieren, die für die weitere Analyse verwendet wird. Das Gating beruht auf der Annahme, dass die Mehrheit der lebensfähigen Zellen eine homogene Zellpopulation auf der Grundlage der FSC- und SSC-Parameter bildet. Durch die Durchführung dieses Schritts können Zelltrümmer, tote Zellen und Zellaggregate weitgehend von der weiteren Analyse ausgeschlossen werden. Eine Darstellung des Angussprozesses ist in Abbildung 1B dargestellt.
- Wählen Sie diese Option, um 20.000 "Ereignisse" (d. h. einzelne Zellen) pro Probe zu analysieren.
Anmerkung: Das bedeutet, dass für jede Probe schließlich 20.000 Zellen analysiert werden, die in den vordefinierten Gate fallen. Die Datenerfassung für jede Stichprobe wird fortgesetzt, bis diese Anzahl von Ereignissen analysiert wurde.
- Starten Sie den Lauf (wählen Sie "Daten aufzeichnen"). Das Durchflusszytometriegerät analysiert nun alle Proben einzeln, indem es die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) für jede Probe aufzeichnet. Dieser MFI entspricht dem mittleren Fluoreszenzsignal, das den 20.000 Zellen entspricht, die innerhalb des vordefinierten Gates liegen.
