>1. Erzeugung eines Plasmids, das das chimäre Konstrukt exprimiert
HINWEIS: Ziel ist es, ein Plasmid zu erzeugen, das die extrazelluläre Domäne des interessierenden Rezeptors exprimiert, das mit den Transmembran- und intrazellulären Domänen der CD3ζ-Kette der Maus fusioniert ist (Abbildung 1A).
- Rufen Sie die Sequenz der extrazellulären Domäne des interessierenden Rezeptors einschließlich des Signalpeptids ab. Gewinnung von DNA-Material, von dem erwartet wird, dass es diesen Rezeptor exprimiert (z. B. cDNA oder ein Plasmid).
- Gewinnung von DNA-Material, das die Transmembran und die intrazellulären Domänen der CD3ζ-Kette der Maus exprimiert (z. B. cDNA oder ein Plasmid).
- Entwerfen Sie die Sequenz des Fusionsproteins basierend auf der in Abbildung 1A gezeigten allgemeinen Struktur. Stellen Sie sicher, dass sich die gesamte Sequenz innerhalb desselben Codon-Leserahmens befindet. Diese Sequenz wird verwendet, um geeignete Primer zu entwerfen und das Endprodukt zu verifizieren.
- Entwerfen Sie zwei PCR-Reaktionen, um jedes der Fragmente der Fusionsproteine separat zu amplifizieren (Abbildung 1B, 1C).
Anmerkung: Die spezifischen Bedingungen für die PCR-Reaktionen (z. B. Verlängerungszeit und Annealing-Temperatur) hängen von der Art der Primer ab, die für einen spezifischen Rezeptor ausgelegt sind.
- Amplifizieren Sie das extrazelluläre Segment des Rezeptors.
- Entwerfen Sie einen 5'-Primer, der einen Teil des Signalpeptids des Rezeptors, eine Kozak-Konsensussequenz und eine geeignete Restriktionsstelle enthält (Abbildung 1B).
- Entwerfen Sie einen 3'-Primer, der beide Teile des Fusionsproteins flankiert (Abbildung 1B). Zum Beispiel kann dieser 3'-Primer für das erste Design die letzten 20 Basenpaare des extrazellulären Segments des Rezeptors und die ersten 9 Basenpaare des CD3ζ-Segments enthalten.
Anmerkung: Es ist nicht erforderlich, dem 3'-Primer eine Restriktionsstelle hinzuzufügen, da dieser Primer zur Erzeugung der fusionierten Sequenz und nicht für die Ligation verwendet wird.
- Amplifizieren Sie das CD3ζ-Segment.
- Entwerfen Sie einen 5'-Primer, der beide Teile des Fusionsproteins flankiert (Abbildung 1C). Zum Beispiel kann der 5'-Primer für das erste Design die letzten 9 Basenpaare des extrazellulären Segments des Rezeptors und die ersten 20 Basenpaare des CD3ζ-Segments enthalten.
Anmerkung: Es ist nicht erforderlich, dem 5'-Primer eine Restriktionsstelle hinzuzufügen, da dieser Primer zur Erzeugung der fusionierten Sequenz und nicht für die Ligation verwendet wird.
- Entwerfen Sie einen 3'-Primer, der das Ende der CD3ζ-Sequenz sowie eine geeignete Restriktionsstelle enthält (Abbildung 1C).
- Korrigieren Sie die Primersequenzen in jeder dieser beiden Reaktionen, so dass die Annealing-Temperatur in jedem Paar ähnlich ist (beachten Sie, dass der Primer, der Sequenzen der beiden Teile des Fusionsproteins enthält, nur mit einem Teil der Sequenz in jeder Reaktion annealt).
- Es wird eine zusätzliche PCR durchgeführt, bei der eine Mischung aus den PCR-Produkten der ersten beiden Reaktionen als DNA-Template mit dem 5'-Primer des extrazellulären Rezeptorsegments (Schritt 1.4.1.1) und dem 3'-Primer des CD3ζ-Segments (Schritt 1.4.2.2) verwendet wird (Abbildung 1D). Diese Reaktion sollte die endgültige fusionierte Sequenz erzeugen.
- Gehen Sie wie beim Klonen üblich vor.
- Ligamieren Sie das PCR-Endprodukt auf den Zielschnittvektor (der Zielvektor ist in der Regel pcDNA3, die G418- und Ampicillinresistenz exprimiert).
- Verwandeln Sie den ligierten Vektor in kompetente Bakterien.
- Tauen Sie 50 μL der kompetenten Bakterien auf Eis auf.
- Geben Sie den ligierten Vektor zu den Bakterien und inkubieren Sie ihn 20 Minuten lang auf Eis.
- Inkubieren Sie bei 42 °C für 45 s.
- Fügen Sie 200 μl LB ohne Antibiotika hinzu.
- 1 h bei 37 °C unter ständigem Schütteln inkubieren.
- Saatgut auf einer LB-Platte mit den entsprechenden Antibiotika (z. B. Ampicillinlösung mit einer Endkonzentration von 0,1 mg/ml).
- Sammeln und züchten Sie mehrere Bakterienkolonien in 5 mL LB (in 15 mL Röhrchen).
- Extrahieren Sie am nächsten Tag Plasmide mit einem Mini-Prep-Kit.
- Analysieren Sie das Geninsert mit Restriktionsenzymen.
- Sequenzieren Sie die relevanten Kolonien und überprüfen Sie, ob die Sequenz und der Leserahmen korrekt sind (wie in Schritt 1.3 angegeben).
- Verwandeln Sie das verifizierte Plasmid in kompetente Bakterien.
- Tauen Sie 20 μl der kompetenten Bakterien auf Eis auf.
- Geben Sie 1 μl des Plasmids zu den Bakterien und inkubieren Sie sie 20 Minuten lang auf Eis.
- Inkubieren Sie bei 42 °C für 45 s.
- Fügen Sie 200 μl LB ohne Antibiotika hinzu.
- 1 h bei 37 °C unter ständigem Schütteln inkubieren.
- Saatgut auf einer bakteriellen Wachstumsfuge mit den entsprechenden Antibiotika (z. B. Ampicillinlösung mit einer Endkonzentration von 0,1 mg/ml).
- Am nächsten Tag züchten Sie eine Bakterienkolonie in einem großen LB-Behälter mit 0,1 mg/ml Ampicillin (~250 mL).
- Führen Sie am nächsten Tag die Maxi-Vorbereitung gemäß den spezifischen Anweisungen des Kits durch.
Anmerkung: Für das Elektroporationsverfahren wird eine große Menge Plasmid benötigt, wie unten beschrieben.
>2. Transfektion des Plasmids, das das chimäre Protein exprimiert, in BW-Zellen
HINWEIS: Verschiedene Methoden können auch für die Transfektion verwendet werden (z.B. durch lentivirale Infektion). Führen Sie vor der Elektroporation eine Ethanolfällung der DNA durch, wie unten beschrieben. Die nächsten Schritte erfordern sterile Bedingungen.
- Bereiten Sie am Vortag die BW5147-Zellen ("BW-Zellen") für die Elektroporation vor. Platte 10 Platten (à 10 cm) mit 10 ml à 100.000 BW5147 Zellen/ml (d. h. insgesamt 10 x 106 Zellen) mit RPMI, ergänzt mit 10 % fötalem Kälberserum (FCS), 1 % Natriumpyruvat, 1 % L-Glutamin, 1 % nicht-essentiellen Aminosäuren und 1 % Penicillin-Streptomycin ("vollständiges Medium").
- Geben Sie 100 μg des pcDNA3-Plasmids, das das Fusionsprotein exprimiert, in ein 1,5-2-ml-Röhrchen und fügen Sie 3 M Natriumacetat bei einem pH-Wert von 5,3-5,5 hinzu. Das Volumen des Natriumacetats sollte 0,1 (10 %) des Volumens des 100-μg-Plasmids entsprechen; titrieren Sie den pH-Wert des Natriumacetats mit einem pH-Messgerät durch Zugabe von NaOH oder HCl.
Das - Gemisch aus Plasmid und Natriumacetat wird wie in Schritt 2.2 beschrieben mit 2,5 Volumenteilen 100 %igem Ethanol zugesetzt (2,5-faches Gesamtvolumen von Plasmid und Natriumacetat). Über Nacht bei -20 °C oder 2 h bei 70 °C inkubieren.
- 24 Stunden nach dem Plattieren der BW-Zellen werden alle BW-Zellen (~100 ml) in 2 50-ml-Röhrchen gesammelt. Die Zellen werden 5 Minuten lang bei 515 x g zentrifugiert und der Überstand verworfen.
- Resuspendieren Sie das Pellet aus beiden Röhrchen in 25 mL RPMI- in einem einzigen 50 mL Röhrchen. Zum Beispiel resuspendieren Sie das Pellet eines Röhrchens mit 25 mL RPMI- und verwenden Sie dann diese Flüssigkeit, um die Flüssigkeit in dem anderen 50 mL Röhrchen wieder zu suspendieren, so dass das gesamte Pellet aus den BW-Zellen in 25 mL Medium in einem einzigen Röhrchen wieder suspendiert wird.
Anmerkung: Das Medium sollte ohne Zusätze sein, da das Serum die Elektroporation beeinträchtigen könnte.
- Zentrifugieren Sie die Zellen erneut für 5 min bei 515 x g. Resuspendieren Sie das Pellet in 1 ml RPMI und geben Sie den Inhalt in eine 0,4 cm große Küvette auf Eis.
- Das Plasmid, das einer Ethanolfällung unterzogen wurde (Schritt 2.3), wird 30 min lang bei 16.000 x g und 4 °C zentrifugiert.
- Einmal mit 1 mL 70%igem Ethanol waschen und weitere 20 min bei 16.000 x g und 4 °C zentrifugieren (zum Auswaschen des Salzes).
- Entfernen Sie das gesamte Ethanol und lassen Sie das Pellet leicht trocknen (d. h. in einem offenen Röhrchen in der Gewebekulturhaube). Resuspendieren Sie das Pellet mit 100 μl RPMI, das zuvor auf 60 °C erhitzt wurde.
- Geben Sie das resuspendierte Plasmid (Schritt 2.8) zu den Zellen in der Küvette und inkubieren Sie es 5 Minuten lang auf Eis.
- Elektropopolieren Sie die Zellen mit 0,23 kV, 250 Kapazität. Dies sollte ~4 ms dauern.
- Die elektroporierten Zellen werden in ein 50-ml-Röhrchen überführt, 50 mL des vollständigen Mediums hinzugefügt und 5 Minuten lang bei 5,15 x g zentrifugiert.
- Den Überstand verwerfen und die Zellen mit 50 ml vollständigem Medium erneut suspendieren.
- Die elektroporierten Zellen werden in 24-Well-Kulturschalen (1 ml pro Well, also insgesamt ~50 Wells) gefüllt und 48 Stunden lang bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert.
- Selektieren Sie die transfizierten Zellen mit Antibiotika. Nach 48 Stunden 1 ml vollständiges Medium, ergänzt mit 10 mg/ml G418, in jede Vertiefung geben (zu diesem Zeitpunkt beträgt das Endvolumen in jeder Vertiefung 2 ml und die Endkonzentration von G418 in jeder Vertiefung 5 mg/ml).
Anmerkung: Wenn das Plasmid eine andere Antibiotikaresistenz enthält, bestimmen Sie vor diesem Schritt die Antibiotikakonzentration, die erforderlich ist, um die nicht transfizierten BW-Zellen abzutöten.
- Entsorgen Sie alle 48 Stunden vorsichtig 1 ml des oberen Volumens jeder Vertiefung, ohne das Medium in der Vertiefung umzurühren (die BW-Zellen befinden sich in der Regel am Boden der Vertiefung). Geben Sie in jede Vertiefung das vollständige Medium, das mit 5 mg/ml G418 ergänzt ist, so dass das endgültige Volumen in jeder Vertiefung wieder 2 ml beträgt.
- Untersuchen Sie die Kulturplatten in allen Vertiefungen regelmäßig auf Zellwachstum.
Anmerkung: Eine Änderung der Farbe des Mediums zu gelb kann helfen, wachsende Zellen zu identifizieren; Am Anfang wird das Medium jedoch aufgrund des G418 selbst gelb sein. Identifizieren Sie positive Wells (Wells mit wachsenden Zellen). Diese Vertiefungen sind G418-resistent und sollen daher das Fusionsprotein exprimieren. Dieser Prozess dauert in der Regel ~3 Wochen.
>3. Überprüfung der Expression des transfizierten Rezeptors in Zellen in den positiven Vertiefungen.
- Färben Sie die transfizierten BW-Zellen mit einem spezifischen Antikörper gegen den Rezeptor, der transfiziert wurde.
- Vergleichen Sie das Expressionsniveau des Rezeptors mittels Durchflusszytometrie mit der Expression der Kontrollzellen (nicht transfizierte BW-Zellen).
- Nach der Verifizierung einer oder mehrerer Vertiefungen können die Zellen sofort für Versuchszwecke verwendet werden, sie in Kultur züchten oder für zukünftige Anwendungen einfrieren.
- Überprüfen Sie die Expression des transfizierten Rezeptors, bevor Sie ein neues Experiment durchführen. Nach einigen Wochen des Wachstums können die Zellen mit G418 mit einer stabilen Rezeptorexpression, G418, aus dem Kulturmedium weggelassen werden.
>4. Inkubation der transfizierten BW-Zellen mit Targets
HINWEIS: Wenn die transfizierten BW-Zellen zum ersten Mal verwendet werden, ist es vorzuziehen, sie an Zielen zu testen, die einen bekannten Liganden des interessierenden Rezeptors exprimieren, oder an plattengebundenen Antikörpern, die spezifisch gegen den interessierenden Rezeptor gerichtet sind (Vernetzungsexperimente; siehe unten, Abschnitt 4.2.1.3).
- Vorzugsweise teilen Sie die BW-Zellen 24 Stunden vor dem Experiment (z. B. durch Zugabe von 10 ml vollständigem Medium zu 2 ml Zellen in Kultur in einer neuen 10-cm-Kulturplatte).
- Inkubieren Sie die transfizierten BW-Zellen mit ihren Zielen. Führen Sie das Experiment gleichzeitig mit Kontroll-BW-Zellen durch, die einen leeren Vektor exprimieren (oder elterliche BW-Zellen). 96F-Platten sind vorzuziehen (es können aber auch 96U-Platten verwendet werden). Führen Sie das Experiment in dreifacher Ausführung durch. Suspendieren Sie alle Zellen im vollständigen Medium.
- Bereiten Sie die Ziele vor. Die Art des Ziels variiert je nach Ziel und kann Zellen, Zellen, die mit Antikörpern vorinkubiert wurden, oder Antikörper allein sein. Dieses System wurde auch mit Bakterien als Ziele verwendet.
- Wenn es sich bei den Zielen um sich teilende Zellen (d. h. Zelllinien) handelt, bestrahlen Sie diese vor dem Assay mit 6.000 rad. Platzieren Sie 50.000 der Zielzellen in einer einzigen Vertiefung einer 96-Platte (in einem Volumen von 100 μl).
- Für Experimente mit Antikörpern und BW-Zellen, die humane FcγR exprimieren, inkubieren Sie die Zielzellen mit einem Antikörper auf Eis in einer 96-Well-Platte (z. B. 50 μl der Zielzellen und 50 μl des Antikörpers; es können unterschiedliche Antikörperdosen getestet werden).
- Wenn Antikörper allein als Ziele verwendet werden (Vernetzungsexperimente), sollten diese plattengebunden werden. Zu diesem Zweck inkubieren Sie die Antikörper zunächst in einem vollständigen Medium in einer 96F-Platte für 1-2 h bei 37 °C und 5% CO2 (eine typische Anfangsdosis beträgt 0,5 μg eines spezifischen Antikörpers in 50 μL). Waschen Sie die Platte, um ungebundene Antikörper zu entfernen.
Anmerkung: In diesem Fall ermöglicht eine 96F-Platte die Bindung des Antikörpers an die Platte, was nach Zugabe der transfizierten BW-Zellen zur Aktivierung des transfizierten Rezeptors führt.
- Fügen Sie die BW-Zellen (Effektorzellen) hinzu. Platzieren Sie 50.000 BW-Zellen in einer einzigen Vertiefung einer 96-Platte (in einem Volumen von 100 μl).
- Vervollständigen Sie das Volumen in jeder Vertiefung auf 200 μl, falls erforderlich.
- Die Platten werden bei 37 °C und 5 % CO2 48 h inkubiert (dieser Zeitraum kann kalibriert werden).
- Frieren Sie die Platten nach 48 Stunden bei -20 °C ein und tauen Sie sie vor dem ELISA auf oder verwenden Sie sie sofort für den ELISA (siehe nächste Schritte).
>5. ELISA
- Beschichten Sie eine ELISA-Platte mit einem Anti-Maus-IL-2-Antikörper (anti-mIL-2). Geben Sie 0,05 μg Anti-mIL-2 in ein Volumen von 50 μl 1x PBS (Phosphatpuffer-Kochsalzlösung) pro Vertiefung. Inkubieren Sie die beschichtete ELISA-Platte mit dem Anti-mIL-2-Antikörper bei 4 °C über Nacht oder bei 37 °C für 2 h.
Anmerkung: Um den ELISA direkt nach dem Inkubationsschritt durchzuführen, sollte die ELISA-Platte 24 h vor Ende der Inkubationszeit der BW-Zellen beschichtet werden.
- Entsorgen Sie die Flüssigkeit in der ELISA-Platte und fügen Sie eine Blockierungslösung (200 μl pro Vertiefung) hinzu, die aus 1x PBS und 1 % Rinderserumalbumin (BSA) besteht. Inkubieren Sie die ELISA-Platte 2 Stunden lang bei Raumtemperatur.
- Waschen Sie die ELISA-Platte dreimal mit 0,05 % PBS-Tween-Lösung (d. h. 0,5 mL Tween-20 in 1 Liter 1x PBS).
- Nehmen wir die 96er-Platte, auf der sich die BW-Zellen befinden, die mit ihren Targets inkubiert wurden (4.3). Wenn die Platte gefroren war, tauen Sie sie vollständig auf (z. B. durch kurze Inkubation bei 37 °C). Zentrifugieren Sie die 96-Well-Platte (5 min, 515 x g) und übertragen Sie vorsichtig 100 μl des Überstands in jeder Vertiefung auf die vorbeschichtete und blockierte ELISA-Platte.
Anmerkung: Der Überstand sollte an den Seiten jeder Vertiefung entnommen werden, um eine Entnahme der Zellen zu vermeiden.
- Falls gewünscht, fügen Sie rekombinantes mIL-2 mit definierten Konzentrationen in eine der leeren Reihen der beschichteten ELISA-Platte hinzu, um eine Standardkurve von mIL-2 zu erzeugen. Beginnen Sie beispielsweise mit einer mIL-2-Konzentration von 2.500 pg/ml und verringern Sie sie dann in jeder nachfolgenden Vertiefung um 50 %. Geben Sie mIL-2 nicht in die letzte Vertiefung.
- Inkubieren Sie die ELISA-Platte über Nacht bei 4 °C oder 2 Stunden lang bei 37 °C.
- Waschen Sie die ELISA-Platte viermal mit PBS Tween.
- Geben Sie Biotin Anti-Maus IL-2 auf die ELISA-Platte. Verwenden Sie eine Konzentration von 1 μg Antikörper in 1 mL 1x PBS mit 1% BSA und teilen Sie sie in 100 μL pro Well.
1 - h bei Raumtemperatur inkubieren.
- Waschen Sie die ELISA-Platte sechsmal mit PBS Tween.
- Fügen Sie HRP-konjugiertes Streptavidin hinzu. Verwenden Sie eine Konzentration von 1 μl Streptavidin in 1 mL PBSX1 mit 1 % BSA und teilen Sie sie in 100 μl pro Vertiefung auf.
- 30 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Waschen Sie die ELISA-Platte sechsmal mit PBS Tween.
- Fügen Sie 100 μl TMB-Substratlösung pro Vertiefung hinzu. Schließen Sie diese Phase schnell ab, um Unterschiede zwischen den Bohrlöchern aufgrund von Zeitverzögerungen beim Hinzufügen des TMB zu minimieren.
- Lesen Sie die ELISA-Platte mit einem ELISA-Platten-Reader bei 650 nm ab (die Messung kann wiederholt werden, wenn das Signal schwach ist).
