Biomembran-Kraftsonde zur Quantifizierung von Rezeptor-Liganden-Wechselwirkungen

Zusammenfassung

Quelle: Chen, Y., et al., Fluoreszenz-Biomembran-Kraftsonde: Gleichzeitige Quantifizierung der Rezeptor-Liganden-Kinetik und der bindungsinduzierten intrazellulären Signalübertragung auf einer einzelnen Zelle. J. Vis. (2015)

In diesem Video werden Biomembran-Kraftsonden (BFPs) verwendet, um die Kräfte zwischen Rezeptoren und Liganden zu messen. Diese Technik kann Wechselwirkungen erkennen, indem der Druck überwacht wird, der erforderlich ist, um die Bindungen zwischen dem pMHC, das auf den Sondenkügelchen konjugiert ist, und den TCRs auf den Zielzellen aufzubrechen.

Protokoll

>1. Isolierung menschlicher RBCs, Biotinylierung und Osmolaritätsanpassung

HINWEIS: Schritt 1.1 sollte von einer ausgebildeten medizinischen Fachkraft wie einer Krankenschwester durchgeführt werden, mit einem vom Institutional Review Board genehmigten Protokoll.

1. Gewinnen Sie 8-10 μl (einen Tropfen) Blut aus einem Fingerstich und fügen Sie es zu 1 ml des Karbonat-/Bikarbonatpuffers hinzu (Materialliste). Die Mischung vorsichtig vortexen oder pipettieren und 1 min bei 900 x g zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie ihn erneut.
2. Wiegen Sie in einem kleinen Becherglas 3,5-4 mg Biotin-PEG3500-NHS-Linker (Materialliste). Löse es im Karbonat/Bicarbonat-Puffer auf, um die Endkonzentration auf 3 mg/ml zu erreichen.
3. Mischen Sie 171 μl Karbonat/Bikarbonat-Puffer, 10 μl Erythrozytenpackung und 1049 μl Biotin-PEG3500-NHS-Linkerlösung und inkubieren Sie 30 Minuten lang bei RT. Waschen Sie die Erythrozyten einmal mit Karbonat/Bikarbonat-Puffer und dann zweimal mit N2-5%-Puffer (Materialliste).
4. In der Zwischenzeit die Linkerflasche mit gelöstem Verschluss in einen mit Trockenmitteln gefüllten Glas-Vakuum-Exsikkator im Boden stellen und 5 min vakuumieren und den Exsikkator mit Argon füllen. Ziehen Sie den Verschluss fest und nehmen Sie die Flasche heraus. Verschließen Sie die Flasche mit einer Paraffinfolie (Materialliste), legen Sie sie in ein mit Trockenmitteln gefülltes Gefäß am Boden und lagern Sie sie bei -20 °C.
   Anmerkung: Die Schritte, die die Verwendung von Biotin-PEG3500-NHS-Linker beinhalten, einschließlich 1.2-1.4 (mit Ausnahme der Inkubation und des Waschens in 1.3), müssen so schnell wie möglich durchgeführt werden.
5. Verdünnen Sie Nystatin in N2-5 %-Puffer, um eine Endkonzentration von 40 μg/ml zu erreichen. Mischen Sie 5 μl biotinylierte Erythrozyten mit 71,4 μl Nystatinlösung (Materialliste) und inkubieren Sie 1 Stunde bei 0 °C. Waschen Sie es zweimal mit N2-5 % Puffer und lagern Sie es mit N2-5 % Puffer + 0,5 % BSA (Materialliste) im Kühlschrank (4 °C).

>2. Glasperlen-Silanisierung

1. Reinigung der Raupenoberfläche
   1. Wiegen Sie 50 mg Glasperlenpulver und suspendieren Sie sie in 500 μl DI-Wasser.
   2. 0,5 ml 30 % H₂O₂ (Materialliste) mit 9,5 ml VE-Wasser in einem 50 ml-Becherglas mischen, dann 2 ml konzentriertes NH₄OH (Materialliste) hinzufügen und diese Lösung in einen Kessel auf einer heißen Platte bringen.
   3. Die Glasperlen in die kochende Lösung geben und weitere 5 Minuten weiterkochen lassen. Die Lösung alle Minuten vorsichtig schwenken.
   4. Nach dem Kochen ~5 ml dieser heißen Bead-Suspension in ein 15-ml-Mikrozentrifugenröhrchen umfüllen und mit RT DI-Wasser auffüllen. Bei 3.500 x g für 5 min zentrifugieren, den Überstand entfernen und entsorgen.
   5. Weitere 5 ml heiße Perlensuspension umfüllen und zu den gewaschenen Kügelchen geben, mit mehr DI-Wasser auffüllen, gut mischen und erneut zentrifugieren. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis etwa 50 ml DI-Wasser verwendet werden, was insgesamt 4 bis 5 Mal Waschen entspricht.
   6. Übertragen Sie die Bead-Suspension in ein 1-ml-Fläschchen. Wiederholen Sie das Waschen der Kügelchen mit Methanol (Materialliste) durch Zentrifugieren bei 17.000 x g für 5 min 3 Mal und suspendieren Sie die Kügelchen schließlich wieder in 1 ml 100% Methanol.
2. Thiolierung der Raupenoberfläche
   1. In ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen werden 45,6 ml Methanol, 0,4 ml Essigsäure (Materialliste), 1,85 ml DI-Wasser, 1,15 ml 3-Mercaptopropyltrimethoxysilan (MPTMS) (Materialliste) und 1 ml Kugelsuspension, die in 2.1 hergestellt wurde, gegeben, dann 3 Stunden lang bei RT inkubiert.
   2. Entfernen Sie nach der Reaktion alle Reaktanten, indem Sie sie einmal mit frischem Methanol waschen, und suspendieren Sie die Kügelchen wieder in 500 μl Methanol. Teilen Sie diese konzentrierte Glasperlensuspension gleichmäßig in ein Set von 20 trockenen und sauberen Glasfläschchen mit Schraubverschlüssen auf. Verdampfen Sie das Methanol mit einem Strahl aus trockenem Argon und drehen Sie die Fläschchen langsam, um eine dünne Schicht trockener Kügelchen an den Seiten jedes Fläschchens zu bilden.
   3. Stellen Sie die Fläschchen mit den Kügelchen für 5 min in den vorgeheizten Trockenofen bei 120 °C, nehmen Sie sie heraus und setzen Sie die Kappe(n) schnell locker auf. Stellen Sie die Fläschchen in einen Vakuum-Exsikkator aus Glas, der mit Trockenmitteln am Boden gefüllt ist, und vakuumieren Sie den Exsikkator mit einer Vakuumpumpe, bis er abgekühlt ist.
   4. Spülen Sie den vakuumierten Exsikkator mit trockenem Argon, um den Exsikkator auf normalen atmosphärischen Druck zu bringen. Entfernen Sie den Exsikkatordeckel und ziehen Sie die Kappe(n) der Durchstechflasche(n) schnell wieder fest. Verschließen Sie die Fläschchen mit Paraffinfolie und bewahren Sie sie bei RT in einer trockenen, dunklen Aufbewahrungsbox auf.
   5. Bei sofortigem Gebrauch ein Fläschchen mit trockenen Kügelchen nehmen und einmal mit Phosphatpuffer waschen (Materialliste), in 50 μl Phosphatpuffer resuspendieren und bei 4 °C lagern. Diese konzentrierte Raupenpräparation wird in den folgenden Schritten als "MPTMS-Kügelchen" bezeichnet.
      Anmerkung: Bei richtiger Lagerung können MPTMS-Kügelchen bis zu drei Monate lang funktionsfähig bleiben.

>3. Funktionalisierung von Beads

1. Kovalente Beschichtung von Proteinen auf Kügelchen
   1. Nehmen Sie ein bestimmtes Volumen (z. B. 2,5 μl) der Proteinbrühe und mischen Sie es mit einem gleichen Volumen an Karbonat/Bicarbonat-Puffer, um Lösung 1,
      Anmerkung: Das Volumen hängt von der Stammkonzentration und der gewünschten Endstellendichte des Proteins auf der Oberfläche der Kügelchen ab.
   2. In einem kleinen Becherglas werden 2-3 mg MAL-PEG3500-NHS-Linker (Materialliste) gewogen und mit Karbonat/Bicarbonat-Puffer gelöst, bis eine Endkonzentration von 0,231 mg/ml erreicht wird.
   3. Lösung 1 wird mit dem gleichen Volumen der in Nummer 3.1.2 hergestellten Linkerlösung gemischt. Inkubieren Sie die Mischung 30 Minuten lang bei RT, um Lösung 2 herzustellen.
   4. In der Zwischenzeit die Linkerflasche mit gelöstem Verschluss in einen mit Trockenmitteln gefüllten Glas-Vakuum-Exsikkator im Boden stellen und 5 min vakuumieren und den Exsikkator mit Argon füllen. Ziehen Sie den Verschluss fest und nehmen Sie die Flasche heraus. Verschließen Sie die Flasche mit einer Paraffinfolie, legen Sie sie in einen mit Trockenmitteln gefüllten Behälter am Boden und lagern Sie sie bei -20 °C.
      Anmerkung: Die Schritte, die die Verwendung des MAL-PEG3500-NHS-Linkers beinhalten, einschließlich 3.1.2-3.1.4 (mit Ausnahme der Inkubation in 3.1.3), müssen so schnell wie möglich durchgeführt werden.
   5. Mischen Sie 5 μl MPTMS-Kügelchen mit Lösung 2 und fügen Sie Phosphatpuffer (Materialliste) hinzu, um ein Endvolumen von 250 μl zu erhalten.
   6. Inkubieren Sie die Kügelchen über Nacht bei RT, waschen Sie sie 3 Mal mit Phosphatpuffer und suspendieren Sie sie wieder in 100 μl Phosphatpuffer und lagern Sie sie bei 4 °C.
2. Herstellung von Protein/Streptavidin (SA)-beschichteten Kügelchen
   1. Befolgen Sie das Protokoll 3.1.1-3.1.4.
   2. Mischen Sie 5 μl MPTMS-Kügelchen mit Lösung 2 und 5 μl 4 mg/ml Streptavidin-Maleimid (SA-MAL) (Materialliste) Lösung und fügen Sie dann Phosphatpuffer hinzu, um ein Endvolumen von 250 μl zu erhalten.
   3. Inkubieren Sie die Kügelchen über Nacht bei RT, waschen Sie sie 3 Mal mit Phosphatpuffer und suspendieren Sie sie schließlich wieder in 100 μl Phosphatpuffer und lagern Sie sie bei 4 °C.
3. Beschichtung von Streptavidin auf Glasperlen
   1. Mischen Sie 5 μl MPTMS-Kügelchen mit 5 μl 4 mg/ml SA-Lösung und fügen Sie 140 μl Phosphatpuffer hinzu.
   2. Inkubieren Sie die Kügelchen über Nacht bei RT, waschen Sie sie 3 Mal mit Phosphatpuffer, suspendieren Sie sie wieder in 50 μl Phosphatpuffer und lagern Sie sie bei 4 °C.
4. Beschichtung der SA-beschichteten Kügelchen mit einem biotinylierten Protein
   1. Mischen Sie 5 μl SA-beschichtete Kügelchen mit dem Protein (Volumen abhängig von der gewünschten Beschichtungsdichte) und fügen Sie Phosphatpuffer hinzu, so dass das endgültige Volumen 100 μl beträgt.
   2. Die Mischung über Nacht bei 4 °C oder 3 Stunden bei RT inkubieren, 3-mal mit Phosphatpuffer waschen und in 50 μl Phosphatpuffer resuspendieren und bei 4 °C lagern.

>4. Zellvorbereitung

HINWEIS: Um die Zellen zu reinigen, befolgen Sie die Standard-Zellreinigungsprotokolle, die dem Typ der verwendeten Zellen entsprechen, z. B. T-Zellen oder bestimmte Zelllinien.

1. Bei fBFP-Experimenten wird nach der Herstellung der Zellsuspension in DMSO gelöstes Fura2-AM (Materialliste) in die Zellsuspension gegeben, um eine Endkonzentration von 2 μM zu erreichen, 30 Minuten lang bei RT inkubieren und dann einmal waschen. Bewahren Sie diese fluoreszierend beladene Zellsuspension bis zur Verwendung im Dunkeln auf.

>5. Vorbereitung für Mikropipetten und eine Zellkammer

1. Vorbereitung von Mikropipetten
   1. Schneiden Sie lange Kapillarglasröhren (Materialliste) mit einem Glasschneider in kurze Stücke von etwa 3 Zoll Länge. Montieren Sie ein Stück auf den Mikropipettenabzieher (Materialliste), klicken Sie auf die Schaltfläche "Ziehen", damit die Mitte der Kapillare von der Maschine erhitzt wird und die Kapillare an den beiden Enden gezogen wird, um zwei Kapillaren mit scharfen Spitzen (rohe Mikropipetten) zu erhalten.
      Anmerkung: Gemäß der Produktrichtlinie hat die gewünschte Morphologie der Rohpipette einen 6-8 mm Kegel und eine 0,1-0,5 μm Spitze.
   2. Montieren Sie eine Rohpipette auf den Pipettenhalter der Mikropipettenschmiede (Materialliste). Erhitzen, um die Glaskugel in der Schmiede zu schmelzen. Führen Sie die Spitze der Rohpipette in die Glaskugel ein. Kühle die Glaskugel ab und ziehe die rohe Pipette, um sie von außen zu brechen, und lasse ihre Spitze in der Kugel. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis Sie die gewünschte Spitzenöffnung erreicht haben.
      Anmerkung: Beispiele für den Innendurchmesser einer Mikropipettenspitze: 2,0-2,4 μm für eine Erythrpette, ~1,5 μm für eine Perle, ~2-4 μm für eine T-Zelle und -7 μm für eine Hybridomzelle.
2. Bau einer Zellkammer
   HINWEIS: Die Zellkammer besteht aus einem selbstgebauten Kammerhalter, der aus zwei Teilen von Metallquadraten (Kupfer/Aluminium) und einem Griff besteht, der sie miteinander verbindet (Abbildung 1D).
3. Schneiden Sie ein Deckglas von 40 mm x 22 mm x 0,2 mm mit einem Glasschneider in zwei 40 mm x 11 mm x 0,2 mm große Stücke (Deckgläser 1 und 2). Kleben Sie Deckglas 1 mit Fett auf die Oberseite des Kammerhalters, so dass es die beiden Metallquadrate überbrückt, und kleben Sie auf ähnliche Weise Deckglas 2 auf die Unterseite, wodurch eine parallele Deckglas-Zellenkammer entsteht (Abbildung 1D).
4. Mit einer Pipette 200 μl experimentellen Puffer zwischen die beiden Deckgläser injizieren. Stellen Sie sicher, dass der Puffer an beiden Deckgläsern befestigt ist. Drehen und schütteln Sie die Kammer vorsichtig, damit der Puffer beide Enden der Kammer berührt.
5. Vorsichtig Mineralöl in beide Seiten der Kammer einspritzen, die die experimentelle Pufferzone flankieren, und so den Puffer von der Luft abdichten. Injizieren Sie Suspensionen von Sondenkügelchen (z. B. pMHC-beschichteten Kügelchen), Erythrozyten und Zielen (z. B. T-Zellen) in den oberen, mittleren bzw. unteren Bereich der Pufferzone.

>4. BFP-Experiment

1. Schalten Sie das Mikroskop (Materialliste) und die Lichtquelle ein. Stellen Sie die Kammer auf den Hauptmikroskoptisch (Abbildung 1A, D).
2. Installieren Sie alle drei Mikropipetten von BFP (Abbildung 1D. Links: Sonde, um eine RBC zu greifen, rechts: Ziel, um eine Zelle oder Perle zu greifen, unten rechts: Helfer, um eine Perle zu greifen).
   1. Verwenden Sie einen Mikroinjektor (Materialliste), um eine Mikropipette mit einem experimentellen Puffer zu vfüllen. Nehmen Sie den Pipettenhalter (Materialliste) ab und halten Sie ihn an einer niedrigeren Stelle, damit Wasser aus der Spitze tropfen kann. Führen Sie die Mikropipette schnell in die Halterspitze ein und stellen Sie sicher, dass während des Einführens keine Luftblase in die Mikropipette gelangt. Ziehen Sie die Halterschraube fest.
   2. Montieren Sie jeden Pipettenhalter auf den entsprechenden Mikromanipulator. Schieben Sie die Mikropipette in Richtung der Kammer, so dass ihre Spitzen in den Pufferbereich der Kammer gelangen. Passen Sie die Position der Mikropipette an und finden Sie sie unter dem Sichtfeld des Mikroskops.
3. Bewegen Sie sich in der Kammerhalterstufe, um die Kolonien von drei Elementen (den RBCs, den Zielen und den Sondenperlen) nacheinander zu finden. Stellen Sie die Position der entsprechenden Mikropipette ein, indem Sie die Knöpfe der Manipulatoren so drehen, dass sich die Spitze der Mikropipette einer Zelle/Perle nähert. Aspirieren Sie die Zelle/den Kügelchen, indem Sie den Druck in der entsprechenden Mikropipette einstellen. Alle drei Mikropipetten erfassen die entsprechenden Elemente.
4. Bewegen Sie sich um die Kammerhalterbühne herum, um einen offenen Raum abseits der Kolonien der injizierten Elemente zu finden, in dem das Experiment durchgeführt wird. Schalten Sie den visuellen Modus des Mikroskops um, um das Bild im Computerprogramm auf dem Computerbildschirm zu visualisieren. Verschieben Sie alle drei Elemente auf den Pipettenspitzen in das Sichtfeld des Programms.
5. Richten Sie die Sondenperle und die Erythrozyten aus und manövrieren Sie die Sondenraupe vorsichtig zur Spitze der Erythrox, treffen Sie die Raupe kurz auf die Erythrampe und ziehen Sie sie vorsichtig zurück. Passen Sie den Druck der Hilfsmikropipette so an, dass die Perle vorsichtig weggeblasen wird, so dass sie auf der RBC-Spitze klebt (Abbildung 1F). Entfernen Sie die Mikropipette und richten Sie das Ziel und die Sondenperle aus (Abbildung 2A).
6. Verwenden Sie im Programm im Sichtfeldfenster die Werkzeuge im Programm, um die jeweiligen Radien der Sondenmikropipette (Rp), des RBC (R0), der kreisförmigen Kontaktfläche zwischen dem RBC und der Sondenperle (Rc) zu messen, was die Abschätzung der Federkonstante des RBC (k) durch die folgende Gleichung ermöglicht, wobei Δp der Aspirationsdruck an der Sondenpipettenspitze ist. Anmerkung: Aus dem Hookeschen Gesetz folgt, dass die Bindungskraft F durch das Produkt aus der Federkonstante und der Verschiebung der Sondenraupe (d) quantifiziert werden kann, d. h. F = d (Abbildung 2C).
   
7. Geben Sie die gewünschte RBC-Federkonstante in das Programm ein (siehe Protokollabschnitt 4.6). Die Federkonstante wird typischerweise auf 0,25 oder 0,3 pN/nm für den Kraftklemmen-Assay und den Adhäsionsfrequenz-Assay und 0,1 pN/nm für den thermischen Fluktuationsassay eingestellt, wodurch ein erforderlicher Aspirationsdruck in der Einheit eines Zentimeters Wasser zurückgegeben wird. Stellen Sie die Höhe des Wassertanks ein, der mit der Pipette der Sonde verbunden ist, bis der erforderliche Ansaugdruck erreicht ist.
8. Zeichnen Sie eine horizontale Linie über den RBC-Apex, die im angrenzenden Fenster eine Kurve ergibt, die die Helligkeit (Graustufenwert) jedes Pixels entlang dieser Linie angibt. Ziehen Sie die Schwellenwertlinie so, dass sie etwa halb so tief wie die Kurve ist (Abbildung 2A, B).
   Anmerkung: Der kleinste Punkt auf der Helligkeitskurve unterhalb der Schwellenwertlinie gibt die Position der Perlengrenze an, so dass nur ein lokales Minimum zulässig ist. Wenn derzeit zwei oder mehr lokale Minima vorhanden sind, deutet dies darauf hin, dass das Bild nicht optimal ist (wahrscheinlich aufgrund eines unscharfen Bildes oder einer schlechten Ausrichtung zwischen der Sondenraupe und der Erythrozyten).
9. Wählen Sie den gewünschten Experimentmodus aus: thermischer Fluktuationsassay, Adhäsionsfrequenzassay oder Force-Clamp-Assay. Stellen Sie die Parameter wie gewünscht ein (z. B. Aufprallkraft = 15 pN, Belastungsrate = 1.000 pN/s, Kontaktzeit = 1 sec, Klemmkraft = 20 pN (für Kraftklemm-Assay) usw.).
   1. Klicken Sie auf "Start", wodurch das Programm die Zielpipette bewegen und das Ziel in den Kontakt mit der Sonde hinein- und wieder herausfahren kann (siehe Abschnitt "Repräsentative Ergebnisse" für Details). Parallel dazu erfolgt die Datenerfassung, die die Position der Sondenraupe in Echtzeit erfasst. Stoppen Sie das Programm, indem Sie auf die Schaltfläche "Experiment stoppen" klicken, woraufhin ein Fenster erscheint, in dem Sie die erfassten Daten speichern können.

Ergebnisse

Abbildung 1: fBFP-Baugruppe.

(A) Ein Übersichtsbild des fBFP-Hardwaresystems. (B) Eine schematische Zeichnung des fBFP-Hardwaresystems. (C) Das Dual-Cam-System "DC2" (orange), auf das die Hochgeschwindigkeitskamera (blau) und eine Fluoreszenzkamera (weiß) montiert wurden. (D) Der Mikroskoptisch, der ei...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Monobasisches Natriumphosphat-Monohydrat (NaH2PO4 • H2O)	Sigma-Aldrich	Nr. S9638	Zubereitung von Phosphatpuffern
Anhy. Natriumphosphat zweibasisch (Na2HPO4)	Sigma-Aldrich	Nr. S7907	Zubereitung von Phosphatpuffern
Natriumcarbonat (Na2CO3)	Sigma-Aldrich	Nr. S2127	Zubereitung von Karbonat/Bikarbonat-Puffer
Natriumbicarbonat (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	Nr. S5761	Zubereitung von Karbonat/Bikarbonat-Puffer
Natriumchlorid (NaCl)	Sigma-Aldrich	Nr. S7653	N2-5% Puffervorbereitung
Kaliumchlorid (KCl)	Sigma-Aldrich	Nr. P9541	N2-5% Puffervorbereitung
Kaliumphosphat einbasisch (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	Nr. P5655	N2-5% Puffervorbereitung
Saccharose	Sigma-Aldrich	Nr. S0389	N2-5% Puffervorbereitung
MAL-PEG3500-NHS	JenKem	Nr. A5002-1	Funktionalisierung von Raupen
Biotin-PEG3500-NHS	JenKem	Nr. A5026-1	Erythrozyten-Biotinylierung
nystatin	Sigma-Aldrich	Nr. N6261	Einstellung der Osmolarität der Erythrozyten
Ammoniumhydroxid (NH4OH)	Sigma-Aldrich	Nr. A-6899	Glasperlen-Silanisierung
Methanol	BDH	Tel.: 67-56-1	Glasperlen-Silanisierung
30% Wasserstoffperoxid (H2O2)	J. T. Barker	Jan-86	Glasperlen-Silanisierung
Essigsäure (Glazial)	Sigma-Aldrich	ARK2183	Glasperlen-Silanisierung
3-Mercaptopropyltrimethoxysilan (MPTMS)	Uct Spezialitäten, llc	Artikel-Nr.: 4420-74-0	Funktionalisierung von Glasperlen
Borosilikatglasperlen	Distrilab Partikeltechnologie	9002	Funktionalisierung von Glasperlen
Streptavidin-Maleimid	Sigma-Aldrich	Nr. S9415	Funktionalisierung von Glasperlen
Bsa	Sigma-Aldrich	Nr. A0336	Funktionalisierung von Liganden
Fura2-AM	Lebenstechnologien	F-1201	Intrazelluläre Beladung mit Calciumfluoreszenzfarbstoffen
Dimethylsulfoxid (DMSO)	Sigma-Aldrich	Nr. D2650	Intrazelluläre Beladung mit Calciumfluoreszenzfarbstoffen
Quantibrite PE Perlen	BD Biowissenschaften	340495	Quantifizierung der Dichte
Kapillarrohr 0,7-1,0 mm x 30 Zoll	Kimble Verfolgungsjagd	Artikel-Nr.: 46485-1	Herstellung von Mikropipetten
Flammender/Brauner Mikropipettenabzieher	Sutter-Instrument	P-97	Herstellung von Mikropipetten
Narishige	Narishige	Narishige	Herstellung von Mikropipetten
Mineralöl	Fisher Scientific	Artikel-Nr.: BP2629-1	Montage der Kammer
Mikroskop-Deckglas	Fisher Scientific	12-544-G	Montage der Kammer
Mikro-Injektor	Welt Präzisionsinstrumente	MF34G-5	Montage der Kammer
1 ml Spritze	Bd	309602	Montage der Kammer
Halter für Mikropipetten	Narishige	HI-7	Montage der Kammer
Mikroskop (TiE invers)	Nikon	MEA53100	BFP-System
Objektiv CFI Plan Fluor 40x (NA 0,75, WD 0,72 mm, Spg)	Nikon	MRH00401	BFP-System
Kamera, GE680, 640 x 480, GigE, 1/3" CCD, mono	Graftek Imaging	02-2020C	BFP-System
Prosilica GC1290 - ICX445, 1/3", C-Mount, 1280 x 960, Mono., CCD, 12 Bit ADC	Graftek Imaging	02-2185A	BFP-System
Manueller Submikron-Sondenkopf mit hochauflösender Fernbedienung	Karl Süss	PH400	BFP-System
Anti-Vibrations-Tisch (5' x 3')	TMC (Englisch)	77049089	BFP-System
Manueller 3D-Translationstisch	Newport	462-XYZ-M
SolidWorks 3D-CAD-Software	SolidWorks 3D-CAD-Software	Version 2012 SP5	BFP-System
LabVIEW-Software	Nationale Instrumente	Fassung 2009	BFP-System, BFP-Programm
3D-Piezo-Translationstisch	Physik Instrumente	M-105.3P	BFP-System
Linearer Piezo-Accuator	Physik Instrumente	P-753.1CD	BFP-System
Karbonat/Bikarbonat-Puffer (pH 8,5)			8,4 g/l Natriumcarbonat (Na2CO3), 10,6 g/l Natriumbicarbonat (NaHCO3)
N2-5% Puffer (pH 7,2)			27,6 g/L NaPhosphat einbasisch (NaH2PO4 • H2O), 28,4 g/L Anhy. NaPhosphat zweibasisch (Na2HPO4)
			20,77 g/l Kaliumchlorid (KCl), 2,38 g/l Natriumchlorid (NaCl), 0,13 g/l monobasisches Kaliumphosphat (KH2PO4), 0,71 g/l anhy. Natriumphosphat zweibasisch (Na2HPO4), 9,70 g/l Saccharose