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>1. Reinigung von GST-markierter GTPase
- Kultivierung eines E. coli-Stammes wie BL21, transformiert mit pGEX-Rac1 O/N bei 37 °C, Schütteln bei 220 U/min, in 500 ml Autoinduktionsmedium (25 mM Na2HPO4, 25 mM KH2PO4, 50 mM NH4Cl, 5 mM Na2SO4, 2 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 0,5 % Glycerin, 0,05 % Glukose, 0,2 % Laktose, 5 g Trypton, 2,5 g Hefeextrakt, 100 μg/ml Ampicillin).
- Ernte der Bakterien durch Zentrifugation für 10 min bei 10.000 x g, 4 °C.
- Bakterielles Pellet in 20 ml Proteinextraktionsreagenz, 1x Proteaseinhibitor resuspendieren und 20 min bei RT mit Inversion inkubieren.
- Das Lysat durch Zentrifugation bei 40.000 x g für 30 min klären.
- Fügen Sie 2 ml Glutathion-Magnetkügelchen hinzu, die mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen wurden (PBS: 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl).
- 2 Stunden inkubieren, durch Inversion bei 4 °C mischen.
- Waschen Sie proteinbeladene Kügelchen viermal mit 10 ml PBS und verwenden Sie dabei einen Magnetpulversortierer, um die Kügelchen bei jedem Schritt auszufällen.
- Resuspendieren Sie proteinbeladene Kügelchen in 2 ml PBS und lagern Sie sie bei -80 °C in 100 μl Aliquoten, bis sie benötigt werden.
>2. Expression von GTPase-bindenden Proteinen
- Am Tag vor dem Experiment transfizieren Sie Plasmide, die für das grün fluoreszierende Protein (GFP)-markierte Versionen jedes GTPase-bindenden Proteins kodieren, wie folgt in einen separaten 75-cm-2-Kolben mit HEK293T. Zur Validierung der Nukleotidbeladung wird GFP-markiertes TrioD1 in einen dritten 75-cm-2-Kolben mit HEK293T transfiziert.
- Polyethylamin auf 1 mg/ml in 100 μl sterilem 150 mM NaCl verdünnen.
- 27 μl verdünntes Polyethylamin zu 223 μl reduziertem Serummedium hinzufügen.
- 12 μg Plasmid-DNA zu 250 μl reduziertem Serummedium hinzufügen.
- Inkubieren Sie jedes Röhrchen 2 Minuten lang bei RT.
- Kombinieren Sie die Polyethylamin- und DNA-Mischungen in einem einzigen Röhrchen und wirbeln Sie es 2 Minuten lang.
- 15-20 min bei RT inkubieren.
- Ersetzen Sie das Wachstumsmedium (Dulbecco's Modified Eagle Media, 10 % fötales Rinderserum, 2 mM L-Glutamin, keine Antibiotika) auf 90 % konfluentem HEK293T durch 5 ml frisches Wachstumsmedium.
- Das kombinierte Polyethylamin/DNA-Gemisch wird in den Kolben gegeben und O/N bei 37 °C, 5 % CO2 inkubiert.
>3. Reinigung von GTPase-bindenden Proteinen
- Spülen Sie die Kolben mit transfizierten Zellen in PBS und entleeren Sie den Kolben für 5 Minuten, wobei Sie freie Flüssigkeit ansaugen.
- Die Zellen in 500 μl Lysepuffer (50 mM Tris-HCl (pH 7,8), 1% Nonidet P-40, 1x Proteaseinhibitor) in ein Mikrofuruge-Röhrchen abkratzen.
- Die Zellen werden durch Mischen durch Inversion bei 4 °C für 30 min lysiert.
- Waschen Sie während der Lyse zwei Chargen von 40 μl GFP-Trap-Kügelchen dreimal mit frischem Lysepuffer und sedimentieren Sie die Kügelchen bei 2.700 x g für 2 Minuten zwischen den Wäschen.
- Klären Sie die Lysate durch Zentrifugation bei 21.000 x g für 10 min.
- Übertragen Sie das geklärte Lysat jedes der konkurrierenden Proteine, um gewaschene GFP-Fallenkügelchen zu trennen und lassen Sie die GFP-Fusionsproteine 2 Stunden lang binden, wobei das Mischen durch Inversion bei 4 °C erfolgt. Halten Sie das Lysat aus GFP-TrioD1-Zellen auf Eis.
- Waschen Sie beladene GFP-Trap-Kügelchen zweimal in 50 mM Tris-HCl (pH 7,8), 50 mM NaCl, 0,7 % (w/v) Nonidet P-40 und zweimal in 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl2, sedimentierende Kügelchen bei 2.700 x g für 2 min zwischen den Wäschen.
- Eluieren Sie GFP-Fusionsproteine durch Zugabe von 40 μl 0,2 M Glycin (pH 2,5) und 30 Sekunden lang auf und ab. Sedimentieren Sie die Kügelchen sofort bei 21.000 x g für 60 s und geben Sie die Flüssigkeit in ein neues Mikrofurchenröhrchen mit 4 μl 1 M Tris-HCl (pH 10,4). Tun Sie dies schnell, um Schäden am gereinigten Protein zu begrenzen.
- Analysieren Sie 1 μl jedes gereinigten Proteins mittels Western Blot und sondieren Sie mit einem Anti-GFP-Antikörper, um die relative Ausbeute unter Verwendung eines quantitativen Blotting-Systems gemäß dem Protokoll des Herstellers zu ermitteln. Alternativ können die Proteinkonzentrationen durch einen Bicinchoninsäure (BCA)-Assay bestimmt werden, was jedoch zu Fehlern führt, wenn die Proteine nicht auf identische Weise mit dem Assay reagieren oder wenn kontaminante Proteine vorhanden sind.
- Ausgleich der molaren Proteinkonzentration durch Zugabe von 50 mM Tris-HCl (pH 7,6) und 20 mM MgCl2.
>4. Nukleotidbeladung der GTPase
- Tauen Sie ein Aliquot der in Schritt 1 hergestellten GST-Rac1-Magnetkügelchen auf.
- Nehmen Sie 90 μl GST-Rac1-Kügelchen und waschen Sie sie dreimal mit 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), 25 mM NaCl, 0,1 mM DTT und 4 mM EDTA, wobei Sie einen Magnetpulversortierer verwenden, um die Kügelchen bei jedem Schritt auszufällen.
- Aspirieren Sie den Puffer aus den Kügelchen und fügen Sie 100 μl, 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), 25 mM NaCl, 0,1 mM DTT und 4 mM EDTA hinzu.
- Je nachdem, ob GDP, GTP oder keine Nukleotidbeladung für das Konkurrenzexperiment erforderlich ist, fügen Sie 12 μl 100 mM GDP, 12 μl 10 mM Guanosin-5'-[γ-Thio]triphosphat (GTPγS) oder kein Nukleotid zu 60 μl GST-Rac1-Kügelchen hinzu.
- Für die Nukleotidbeladungskontrollen teilen Sie die verbleibenden Kügelchen in drei 10-μl-Aliquots auf und geben Sie 2 μl 100 mM GDP, 2 μl 10 mM GTPγS oder kein Nukleotid in jedes Röhrchen.
- Die Perlmischungen 30 min bei 30 °C unter Rühren inkubieren.
- Nukleotidgebundenes Rac1 wird durch Zugabe von 1 M MgCl2 stabilisiert: 3 μl zum Versuchsmix (Schritt 4.4) und 0,5 μl zu jedem der Kontrollmixe (Schritt 4.5).
>5. Bindung an den Wettbewerb
- Richten Sie 6 Mikrofugenröhrchen ein, die jeweils Folgendes enthalten:
200 μl 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl2
10 μl experimentelle nukleotidbeladene Rac1-Kügelchen (aus Schritt 4.7)
5 μl Rac1-bindendes Protein A (konstant bindendes Protein)
- Geben Sie zu jedem Röhrchen 0, 1, 2,5, 5, 10 oder 20 μl Rac1-bindendes Protein B (variables Bindungsprotein). Diese Volumina gehen von ungefähr gleichen Stammkonzentrationen der konstanten und variablen Bindungsproteine aus und müssen möglicherweise angepasst werden.
- Passen Sie die Volumina der Bindungsproteine A und B an, wenn es große Unterschiede in den Bindungsaffinitäten der beiden Proteine gibt und dies empirisch durch die experimentellen Wiederholungen bestimmt werden sollte. Das Gesamtvolumen des Bindungsgemisches wird durch Zugabe von 50 mM Tris-HCl (pH 7,6) und 20 mM MgCl2 auf 235 μl aufgefüllt.
- Stellen Sie ein Mikrofuge-Röhrchen auf, das Folgendes enthält:
200 μl 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl2
10 μl experimentelle nukleotidbeladene Rac1-Kügelchen (aus Schritt 4.7)
10 μl Rac1-bindendes Protein A (konstant bindendes Protein)
- Richten Sie GDP, GTPγS und keine Nukleotidkontrollröhrchen ein:
200 μl 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl2
10 μl Kontroll-Rac1-Kügelchen, die in Schritt 4.5 mit GDP, GTPγS oder ohne Nukleotid geladen und in Schritt 4.7.
180 μl HEK293T GFP-TrioD1-Lysat, hergestellt wie in Schritt 3.6
4 μl 1 M MgCl2
- Die Mischung 2 Stunden lang inkubieren und durch Inversion bei 4 °C mischen.
- Waschen Sie die Kügelchen dreimal mit 50 mM Tris-HCl (pH 7,6) und 20 mM MgCl2.
- Eluierte gebundene Proteine in 20 μl reduzierendem Probenpuffer (50 mM Tris-HCl (pH 7), 5 % SDS, 20 % Glycerin, 0,02 mg/ml Bromphenolblau, 5 % β-Mercaptoethanol).