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>1. Herstellung von Influenza-Antigen-Microarrays
- Drucken von Antigenen auf Microarray-Objektträger
- Rekonstituieren Sie jedes lyophilisierte Antigen bis zu einer Konzentration von 0,1 mg/ml in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit 0,001 % Tween-20 (T-PBS). Übertragen Sie 10 μl jedes rekonstituierten Antigens in einzelne Vertiefungen einer unbehandelten 384-Well-Platte mit flachem Boden.
- Drucken Sie Antigene mit einem Microarray-Drucker mit Microarray-Spotting-Pins mit geringem Volumen, die das Antigen in den Probenkanal aspirieren und durch direkten Kontakt und Kapillarwirkung auf 16-Pad-Nitrozellulose-beschichtete Glasobjektträger ablegen.
- Programmieren Sie die Drucksoftware (z. B. Gridder) mit der Quellplattenkonfiguration und den Druckparametern.
- Verwenden Sie das Pulldown-Menü, um den Namen des Plattentyps auszuwählen, der mit dieser Druckmethode verwendet werden soll. Verwenden Sie für diese Studie eine unbehandelte 384-Well-Platte mit flachem Boden.
- Wählen Sie das Textfeld neben Anzahl der Platten aus und geben Sie die Anzahl der Probenplatten ein, die in diesem Druckprotokoll verwendet werden sollen. Verwenden Sie für diese Studie 1 Platte.
- Wählen Sie eine Pin-Konfiguration aus, die mit dieser Methode verwendet werden soll. Verwenden Sie für diese Studie eine 8-polige Konfiguration.
- Stellen Sie sicher, dass die Ursprungsversätze die Abstände (in X- und Y-Richtung) zwischen dem Folienursprung (der im Verwaltungsbereich kalibriert wird) und der Position sind, an der die Druckstifte mit dem Drucken auf den Folien beginnen.
- Definieren Sie auf der Registerkarte Array-Design die Größe und Form der Arrays (Punktabstand und Anzahl der Punkte pro Subarray). Drucken Sie für diese Studie 324 Spots (180 μm Durchmesser mit 300 μm Abstand) mit 8 Pins auf 16-Pad-Objektträger im Format 18x18.
- Wählen Sie die Parameter aus, wie die Druckstifte Proben aufnehmen und dosieren. Für diese Studie aspiriert jeder Pin 250 nL Antigenlösung und druckt 1 nL auf jeden der 40 Spots (insgesamt 20 Objektträger für alle 8 Pins)
- Konfigurieren Sie das Pin-Reinigungsprotokoll und das Blotting-Protokoll. Für diese Studie wird jedes Pin-Print-Antigen in steriles ddH2O in einem beschallten Waschbehälter getaucht und dann das nächste Antigen aspiriert.
- Legen Sie die Reihenfolge fest, in der die Beispielblöcke auf die Objektträger gedruckt werden. Die Array-Software erstellt eine kommentierte Gitterindexdatei (.gal), um die Anordnung der Antigene innerhalb jedes Microarrays zu beschreiben.
Anmerkung: Die obere Reihe wird für Fiduciale (mit Fluoreszenz bei allen Wellenlängen, die in der Bildgebung verwendet werden, z. B. eine Mischung aus Qdot 585 nm Streptavidin-Konjugat und Qdot 800 nm Streptavidin-Konjugat in dieser Studie) verwendet, um Gitter während der Bildgebung auszurichten. Bei hohen Auflagen können Antigene in der Ausgangsplatte periodisch durch Auf- und Abpipettieren und anschließendes Zentrifugieren resuspendiert werden, oder es kann eine neue Ausgangsplatte vorbereitet und verwendet werden.
- Legen Sie ungeprüfte Microarray-Objektträger in eine lichtdichte Box und bewahren Sie sie zur Langzeitlagerung in einem Exsikkatorschrank bei Raumtemperatur auf.
Anmerkung: Das Protokoll kann zu diesem Zeitpunkt auf unbestimmte Zeit pausiert werden.
- Durchführung einer Qualitätskontrolle (Poly-Histidin-Tags erforderlich)
- Befestigen Sie den Objektträger an den Sondierungskammern und rehydrieren Sie ihn mit einem Blockierungspuffer, wie in den Schritten 2.1.1 bis 2.1.2 beschrieben und in Abbildung 1 gezeigt.
- Verdünnen Sie den monoklonalen Poly-His-Antikörper der Maus 1:100 in gefiltertem 1x Blocking-Puffer.
Anmerkung: Wenn nicht gereinigte Proteinantigene (z. B. in einem In-vitro-Transkriptions- und Translationssystem exprimiert) direkt zum Drucken von Microarrays verwendet werden, fügen Sie Komponenten des Proteinexpressionssystems (z. B. E. coli-Lysat) in einem Verhältnis von 1:10 mit dem Blockierungspuffer hinzu, der für die Serumverdünnung verwendet wird, um alle Antikörper zu blockieren, die gegen diese Komponenten gerichtet sind.
- Nach der Aspiration werden 100 μl verdünnter poly-His-Antikörper in jede Objektträgerkammer mit dem Array-Pad gegeben und 2 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C auf einem Shaker inkubiert. 3x mit T-TBS-Puffer waschen, wie in Schritt 2.2.1 beschrieben. Biotin-konjugierter Ziegen-Anti-Maus-IgG-Sekundärantikörper 1:200 in Blockierungspuffer verdünnen, nach der Aspiration 100 μl pro Vertiefung zugeben und 1 h bei Raumtemperatur auf einem Schüttler inkubieren. 3x mit T-TBS-Puffer waschen.
- Verdünnen Sie Qdot 585 nm Streptavidin-Konjugat auf 4 nM in Blockierungspuffer, fügen Sie nach der Aspiration 100 μl pro Vertiefung hinzu und inkubieren Sie 1 h bei Raumtemperatur auf dem Schüttler. 3x mit T-TBS-Puffer waschen, dann einmal mit TBS-Puffer (ohne Tween).
- Zerlegen und quantifizieren Sie Objektträger, wie in den Schritten 2.2.5 – 3.1.2.
beschrieben
Anmerkung: Proteinantigene müssen His10-Tags enthalten, um dieses Qualitätskontrollprotokoll verwenden zu können. Wenn ein anderer Tag enthalten ist, kann alternativ eine Qualitätskontrolle mit einem Antikörper oder Liganden für diesen Tag durchgeführt werden.
>2. Sonden für Influenza-Antikörper mit Microarrays
- Inkubieren Sie Seren auf Microarrays für die Antikörperbindung.
- Befestigen Sie Microarray-Objektträger mit Clips an den Kammern und platzieren Sie sie in Rahmen, wie in Abbildung 2.
gezeigt
Anmerkung: Vermeiden Sie immer, das Microarray-Pad mit Händen und Instrumenten zu berühren. Stellen Sie sicher, dass die Folien mit der Pad-Seite nach oben und der kleinen Kerbe in der oberen rechten Ecke ausgerichtet sind.
- Rehydrieren Sie Microarray-Objektträger mit 100 μl gefiltertem 1x Blockierungspuffer pro Well und verdünnen Sie das Serum 1:100 in 100 μl Blockierungspuffer (kann unbehandelte 96-Well-Platten oder 2-ml-Röhrchen verwenden). Inkubieren Sie sowohl rehydrierte Microarray-Objektträger in abgedeckten Rahmen als auch verdünnte Seren separat für 30 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Orbitalschüttler bei 100-250 U/min. Führen Sie alle nachfolgenden Inkubationsschritte auf dem Schüttler auf ähnliche Weise durch.
Anmerkung: Seren sollten aliquotiert und für die Langzeitlagerung bei -80 °C eingefroren werden, um Gefrier-Tau-Zyklen zu minimieren, und sollten vor der Verwendung zum Mischen vortext und zentrifugiert werden, um Partikel zu entfernen. Beobachten Sie die Objektträgerkammern während und nach diesem Schritt sorgfältig, um Leckagen zu erkennen, die einen erneuten Zusammenbau der Objektträgerkammern erforderlich machen.
- Saugen Sie den Blockpuffer mit Pipettenspitzen, die an eine Vakuumleitung mit einem sekundären Auffangkolben angeschlossen sind, vorsichtig aus der Ecke jeder Kammer ab, ohne die Pads zu berühren. Führen Sie alle nachfolgenden Aspirationsschritte auf ähnliche Weise aus. Geben Sie verdünnte Seren schnell nach der Aspiration zu den Pads, damit die Pads nicht trocknen.
- Legen Sie abgedeckte Rahmen in Tabletts in einen Sekundärbehälter, der von feuchten Papiertüchern umgeben und versiegelt ist, um eine Verdunstung zu verhindern. Über Nacht bei 4 °C auf einem Schaukelschüttler inkubieren (alternativ kann 2 h bei Raumtemperatur auf einem Orbitalschüttler bei 100-250 U/min inkubiert werden).
- Markierungsgebundene Serumantikörper mit Quantenpunkt-konjugierten Sekundärantikörpern
- Seren werden wie oben beschrieben vorsichtig aus den Kammern aspiriert, 100 μl T-TBS-Puffer pro Vertiefung hinzugefügt (20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,05 % Tween-20 in ddH2O, angepasst an pH 7,5 und filtriert, können kommerziell bezogen werden) und 5 Minuten lang auf einem Orbitalschüttler bei 100-250 U/min inkubieren. Wiederholen Sie diesen Waschschritt insgesamt 3x (alle folgenden Waschschritte werden auf ähnliche Weise durchgeführt).
- Bereiten Sie eine Mischung aus Sekundärantikörpern vor, die auf 1 μM in Blockierungspuffer verdünnt sind, und mischen Sie sie gründlich durch Pipettieren vor und während der Anwendung, um die Homogenität zu erhalten.
Anmerkung: Um die Reproduzierbarkeit des Assays zu erhalten, sollte die gleiche Charge jedes Sekundärantikörpers für alle Sondierungsexperimente verwendet werden, für die ein quantitativer Vergleich der Daten zwischen den Experimenten geplant ist. Die spezifische Konzentration des Sekundärantikörpers muss je nach Affinität möglicherweise variiert werden. Befolgen Sie die Protokolle des Herstellers, wann immer verfügbar.
- Nach dem letzten Waschen wird der Puffer aus den Kammern aspiriert, 100 μl pro Vertiefung der Sekundärantikörpermischung zugegeben und 2 Stunden lang bei Raumtemperatur auf einem Schüttler inkubiert.
- Aspirieren Sie das Sekundärantikörpergemisch, waschen Sie es 3x mit T-TBS-Puffer und waschen Sie es dann einmal mit TBS-Puffer (ohne Tween).
- Zerlegen Sie die Microarray-Objektträger vorsichtig aus den Kammern, um eine Berührung der Pads zu vermeiden, spülen Sie sie vorsichtig mit gefiltertem ddH2O aus und trocknen Sie sie, indem Sie sie in 50-ml-Röhrchen geben und 10 Minuten lang bei 500 x g zentrifugieren.
- Legen Sie die sondierten Microarray-Objektträger in eine lichtdichte Box und bewahren Sie sie zur Langzeitlagerung in einem Exsikkatorschrank bei Raumtemperatur auf.
Anmerkung: Das Protokoll kann zu diesem Zeitpunkt für bis zu 1 Woche pausiert werden.
>3. Quantifizierung der Antikörperbindung an Antigene innerhalb des Microarrays
- Visualisieren Sie Microarray-Objektträger und quantifizieren Sie die Fluoreszenzintensität vor Ort, um die Antikörperbindung zu messen.
- Erfassen Sie Bilder von Microarray-Objektträgern mit dem tragbaren Imager mit integrierter Software.
- Wählen Sie auf der Registerkarte Imager konfigurieren die richtige Folienkonfiguration aus. Verwenden Sie für diese Studie Folien mit 16 Blöcken.
- Wählen Sie auf der Registerkarte "Bildsteuerung" den richtigen Fluoreszenzkanal aus und passen Sie die Verstärkung, die Belichtungszeit und die Aufnahmezeit in Abhängigkeit von der Reaktivität der Seren an, um optimale Bilder zu erhalten. Für diese Studie betrugen die Fluoreszenzkanäle für IgA und IgG 585 nm bzw. 800 nm, und die Bildgebungseinstellungen betrugen eine Verstärkung von 50, eine Belichtungszeit von 500 ms und eine Erfassungszeit von 1 s.
- Klicken Sie auf Aufnehmen, um den Vorgang der Bildaufnahme zu starten.
Anmerkung: Microarray-Objektträger können mit mehreren Einstellungen neu abgebildet werden, ohne dass die Signale beeinträchtigt werden, solange sie dunkel und trocken gelagert werden. Andere bildgebende Systeme können verwendet werden, wenn sie mit den Objektträgern kompatibel sind.
- Erkennen Sie Array-Spots mithilfe von Gittern, die auf den Passermarken basieren, und messen Sie die Spot-Intensität als Median der Pixelintensität abzüglich des um die Spots gemessenen Hintergrunds. Führen Sie diesen Quantifizierungsalgorithmus im Batch mit der integrierten Imager-Software durch, die die in Schritt 1.1.2 erstellte .gal-Datei verwendet, um die Spot-Intensitäten mit einzelnen Antigenen auf jedem Microarray zu verbinden.
- Laden Sie im Bereich "Dateiinformationen" die .gal-Datei hoch, indem Sie den entsprechenden Ordner auf dem Computer auswählen, und geben Sie im Abschnitt "Analyseoptionen" den Ordner an, in dem die Analyseausgabedateien gespeichert werden sollen.
- Öffnen Sie auf der Registerkarte Bildsteuerung eines der aufgenommenen Bilder, die quantifiziert werden sollen, und wählen Sie die Schaltfläche Auto in der oberen rechten Ecke.
- Erstellen Sie im Abschnitt "Array-Analyse" in der unteren rechten Ecke eine Passermarkenvorlage, wie von der Software angewiesen.
- Klicken Sie auf die Stapelanalyse, wählen Sie den Ordner aus, der die zu quantifizierenden Bilder enthält, und wählen Sie die Passermarkenvorlage aus, die im vorherigen Schritt erstellt wurde. Die Software analysiert jedes Bild und quantifiziert die Spot-Intensität.
Anmerkung: Dieser Schritt erzeugt eine .csv Datei mit Spot-Intensitäten, die Antikörper in jeder Serumprobe quantifizieren, die an jedes einzelne Antigen auf dem Microarray binden und anschließend in Tabellenkalkulations- oder Analysesoftware manipuliert werden können.
- Analysieren Sie Rohdaten, um die Antikörperbindung zwischen Antigenen und Serumproben zu vergleichen. Für diese Studie wurden IgA- und IgG-Antikörper, die als Fluoreszenzspot-Intensitäten von 585 nm und 800 nm gemessen wurden, über alle Antigene hinweg zwischen 2 unabhängigen Durchläufen des Experiments mit verschiedenen Objektträgern an verschiedenen Tagen verglichen, und es wurde eine Korrelationsanalyse durchgeführt, um die Reproduzierbarkeit des Assays zu messen.
Anmerkung: Bei nicht gereinigten Proteinen, die als Expressionsmischung gedruckt werden, sollte die Datenanalyse mit einer Hintergrundsubtraktion beginnen, bei der keine DNA-Kontrolle vorhanden ist.
