TIRF-Mikroskopie zur Visualisierung der Kopplungsdynamik von Aktin und Mikrotubuli

Zusammenfassung

Quelle: Henty-Ridilla, J.L., Visualisierung der Aktin- und Mikrotubuli-Kopplungsdynamik in vitro durch Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie (TIRF). J. Vis. Exp. (2022)

Dieses Video beschreibt TIRF, eine auf Totalreflexionsmikroskopie basierende Technik zur Visualisierung der Polymerisationsdynamik von Aktin und Mikrotubuli. Die Methode ermöglicht die hochauflösende Abbildung der Kopplungsdynamik von Aktin und Mikrotubuli in Echtzeit, was für das Verständnis zellulärer Wechselwirkungen unerlässlich ist.

Protokoll

>1. Waschen der Deckgläser

HINWEIS: Waschen (24 mm x 60 mm, #1,5) Deckgläser gemäß Smith et al., 2013.

1. Ordnen Sie Deckgläser in einem Plastikbehälter an
.
2. Tauchen Sie die Deckgläser nacheinander in die folgenden Lösungen und beschallen Sie sie 30-60 Minuten lang, wobei Sie zwischen jeder Lösung 10 Mal mit ddH₂O spülen: ddH₂O mit einem Tropfen Spülmittel; 0,1 M KOH. Bewahren Sie Deckgläser in 100% Ethanol bis zu 6 Monate auf.
   Anmerkung: Berühren Sie Glasoberflächen nicht mit unbehandschuhten Fingern. Verwenden Sie stattdessen eine Pinzette.

>2. Beschichtung gereinigter (24 mm x 60 mm, #1,5) Deckgläser mit mPEG- und Biotin-PEG-Silan

HINWEIS: Dieses Protokoll verwendet speziell ein Biotin-Streptavidin-System, um Aktin und Mikrotubuli innerhalb der TIRF-Bildgebungsebene zu positionieren. Andere Beschichtungen und Systeme können verwendet werden (z. B. Antikörper, Poly-L-Lysin, NEM-Myosin usw.).

1. Auftauen von Aliquoten von PEG-Silan- und Biotin-PEG-Silan-Pulvern.
2. Lösen Sie PEG-Pulver in 80 % Ethanol (pH 2,0) auf, um Beschichtungslösungen von 10 mg/ml mPEG-Silan und 2-4 mg/ml Biotin-PEG-Silan zu erhalten, kurz bevor Sie verwendet werden.
   Anmerkung: PEG-Pulver erscheinen oft aufgelöst, befinden sich jedoch möglicherweise nicht auf mikroskopischer Ebene. Die richtige Resuspension dauert ~1-2 Minuten bei ständigem Pipettieren. Es wird empfohlen, nach dem Auftreten der Pulverauflösung weitere 10 Mal zu pipettieren.
   Vorsicht: Tragen Sie Handschuhe, um die Haut vor konzentriertem HCl zu schützen, wenn Sie 80%iges Ethanol (pH 2,0) herstellen.
3. Entfernen Sie das saubere Deckglas (24 mm x 60 mm, #1,5) mit einer Pinzette aus der Ethanollagerung. Mit Stickstoffgas trocknen und in einer sauberen Petrischale aufbewahren.
4. Deckgläser mit 100 μl Beschichtungslösung: ein Gemisch aus 2 mg/mL mPEG-Silan (MW 2.000) und 0,04 mg/mL Biotin-PEG-Silan (MW 3.400) in 80 % Ethanol (pH 2,0).
   Anmerkung: Für eine spärliche Beschichtung (empfohlen) verwenden Sie 2 mg/ml mPEG-Silan und 0,04 mg/ml Biotin-PEG-Silan. Für eine dichte Beschichtung verwenden Sie 2 mg/mL mPEG-Silan, 4 mg/mL Biotin-PEG-Silan.
5. Deckgläser mindestens 18 h oder bis zur Verwendung bei 70 °C inkubieren.
   Anmerkung: Beschichtete Deckgläser zersetzen sich, wenn sie länger als 2 Wochen bei 70 °C gelagert werden.

>3. Zusammenbau von bildgebenden Strömungskammern

1. Schneiden Sie 12 Streifen doppelseitiges Klebeband auf eine Länge von 24 mm ab. Entfernen Sie eine Seite der Klebebandunterlage und befestigen Sie die Klebebandstücke neben den sechs Rillen in einer sauberen Bildgebungskammer.
   Anmerkung: Das Klebeband muss für eine ordnungsgemäße Montage flach sein, da sonst die Bildgebungskammern undicht werden. Entfernen Sie vorsichtig die Klebebandrückseite, um Stöße zu vermeiden. Es wird empfohlen, abgeklebte Kammern auf eine saubere Oberfläche zu schieben, um die Kontakte zwischen Klebeband und Kammer zu glätten.
2. Entferne das zweite Stück Klebeband, um die klebrige Seite des Klebebandes entlang jeder Kammerrille freizulegen. Legen Sie das Kammerband mit der Seite nach oben auf eine saubere Oberfläche.
3. Epoxidharz und Härterlösungen 1:1 (oder nach Herstellerangaben) in einer kleinen Waage mischen.
4. Verwenden Sie eine P1000-Spitze, um einen Tropfen gemischtes Epoxidharz zwischen die Bandstreifen am Ende jeder Rille der Bildkammer zu geben (roter Pfeil; Abbildung 1A). Legen Sie das Kammerband/die Epoxidseite nach oben auf eine saubere Oberfläche.
5. Entfernen Sie ein beschichtetes Deckglas aus dem 70 °C Inkubator. Beschichtete und unbeschichtete Oberflächen von Deckgläsern sechsmal mit ddH₂O spülen, mit gefiltertem Stickstoffgas trocknen und dann mit der Deckglas-Beschichtungsseite zum Klebeband hin in der Bildgebungskammer anbringen.
6. Verwenden Sie eine P200- oder P1000-Pipettenspitze, um Druck auf die Band-Glas-Schnittstelle auszuüben, um eine gute Abdichtung zwischen dem Band und dem Deckglas zu gewährleisten.
   Anmerkung: Bei richtiger Versiegelung wird doppelseitiges Klebeband durchscheinend. Bildgebungskammern, in denen nicht genügend Bandkammerkontakte vorhanden sind, werden undicht.
7. Inkubieren Sie zusammengesetzte Kammern mindestens 5-10 Minuten bei Raumtemperatur, damit das Epoxidharz die Kammervertiefungen vor der Verwendung vollständig abdichten kann. Die Perfusionskammern verfallen innerhalb von 12-18 Stunden nach der Montage.
   Anmerkung: Abhängig von der Platzierung des Bandes und der Dicke des verwendeten doppelseitigen Klebebandes hat die zusammengesetzte Kammer ein Endvolumen von 20-50 μL.

>4. Konditionierung von Perfusionskammern

1. Verwenden Sie eine Perfusionspumpe (auf 500 μl/min eingestellt), um die Konditionierungslösungen in der Perfusionskammer wie folgt nacheinander auszutauschen:
   1. 50 μl 1 % BSA zur Grundierung der Bildgebungskammer. Entfernen Sie überschüssigen Puffer aus dem Luer-Lock-Anschlussbehälter.
   2. Durchfluss 50 μl von 0,005 mg/ml Streptavidin. 1-2 min bei Raumtemperatur inkubieren. Entfernen Sie überschüssigen Puffer aus dem Behälter.
   3. Fließen Sie 50 μl 1 % BSA, um unspezifische Bindungen zu blockieren. 10-30 s inkubieren. Entfernen Sie überschüssigen Puffer aus dem Behälter.
   4. Durchfluss 50 μl warme (37 °C) 1x TIRF-Puffer (1x BRB80, 50 mM KCl, 10 mM DTT, 40 mM Glukose, 0,25 % (v/v) Methylcellulose (4.000 cp)).
      Anmerkung: Entfernen Sie den überschüssigen Puffer nicht aus dem Behälter. Dadurch wird ein Austrocknen der Kammer verhindert, wodurch Luftblasen in das System gelangen können.
   5. Optional: 50 μl stabilisierte und 50 % biotinylierte Mikrotubuli-Seeds in 1x TIRF-Puffer verdünnt.
      Anmerkung: Die richtige Verdünnung muss empirisch bestimmt werden und eine Variabilität von Charge zu Charge enthalten. Eine Verdünnung von 10-30 Samen pro Sichtfeld funktioniert gut mit diesem Setup.

>5. Vorbereitung des Mikroskops

HINWEIS: Biochemische Reaktionen, die dynamische Aktinfilamente und Mikrotubuli enthalten, werden mit einem invertierten Totalreflexionsfluoreszenzmikroskop (TIRF) visualisiert/durchgeführt, das mit 120-150 mW Festkörperlasern, einem temperaturkorrigierten 63x Ölimmersions-TIRF-Objektiv und einer EMCCD-Kamera ausgestattet ist. Proteine in diesem Beispiel werden bei den folgenden Wellenlängen visualisiert: 488 nm (Mikrotubuli) und 647 nm (Aktin).

1. Stellen Sie das Tisch-/Objektivheizgerät so ein, dass es mindestens 30 Minuten vor der Abbildung der ersten biochemischen Reaktion 35-37 °C hält.
2. Legen Sie die Bildaufnahmeparameter wie folgt fest:
   1. Stellen Sie das Erfassungsintervall auf alle 5 s für 15-20 Minuten ein.
   2. Stellen Sie die Laserbelichtungen 488 und 647 auf 50-100 ms bei 5 % bis 10 % Leistung ein. Stellen Sie den entsprechenden TIRF-Winkel für das Mikroskop ein.
      Anmerkung: Unabhängig von der Konfiguration des Mikroskops besteht der einfachste Weg, die Laserleistung, die Belichtung und den TIRF-Winkel einzustellen, darin, Anpassungen an Bildern eines der beiden Polymere allein vorzunehmen (siehe 5.2.2.1 und 5.2.2.2 unten). Den Benutzern wird dringend empfohlen, die niedrigsten Laserleistungs- und Belichtungseinstellungen zu verwenden, die noch eine Erkennung ermöglichen.
      1. Passen Sie die Polymerisationsreaktion an (Abbildung 1C), um die Assemblierung des Aktinfilaments zu initiieren und Bilder bei 647 nm aufzunehmen. Nehmen Sie entsprechende Anpassungen vor.
      2. Passen Sie die Polymerisationsreaktion in einer zweiten konditionierten Perfusionsvertiefung an, um die Mikrotubuli-Assemblierung zu initiieren (Abbildung 1C) und bei 488 nm zu visualisieren. Nehmen Sie entsprechende Anpassungen vor.

>6. Herstellung von Proteinreaktionsmischungen

1. Bereiten Sie eine Stammlösung aus fluoreszenzmarkiertem Tubulin vor.
   1. Bestimmen Sie die Konzentration von hausgemachtem, unmarkiertem Tubulin mittels Spektrophotometrie bei Abs₂₈₀ wie folgt:
      1. Blindes Spektralphotometer mit 1xBRB80 ohne GTP.
      2. Berechnen Sie die Tubulinkonzentration unter Verwendung des ermittelten Extinktionskoeffizienten von 115.000 ^{M-1 cm-1} und der folgenden Formel:
         
   2. Resuspendieren Sie kommerziell hergestelltes lyophilisiertes, mit Lysin markiertes 488-Tubulin auf 10 μM (1 mg/ml; 100 % Markierung) mit 20 μl 1x BRB80 ohne GTP.
   3. Tauen Sie ein 7,2 μl Aliquot von 100 μM unmarkiertem recyceltem Tubulin auf Eis auf.
      Anmerkung: Recyceltes Tubulin ist entscheidend für eine erfolgreiche Mikrotubuli-Assemblierung in vitro, da es polymerisationsinkompetente Dimere entfernt, die in gefrorenen Proteinstämmen gebildet werden.
   4. Kombinieren Sie 3 μl 10 μM 488-Tubulin mit dem 7,2 μl Aliquot von 100 μM unmarkiertem Tubulin, nicht mehr als 15 Minuten vor der Verwendung.
2. Bereiten Sie die Stammlösung aus fluoreszenzmarkiertem Aktin vor.
   1. Bestimmen Sie bei hausgemachten Proteinen die Konzentration und die prozentuale Markierung von Aktin mittels Spektrophotometrie AbsAbs₂₉₀ und Abs₆₅₀ wie folgt:
      1. Blindes Spektralphotometer mit G-Puffer.
      2. Berechnen Sie die Konzentration von unmarkiertem Aktin unter Verwendung des ermittelten Extinktionskoeffizienten von 25.974 ^{M-1 cm-1} und der folgenden Formel:
         
      3. Berechnen Sie die Konzentration von Lysin, markiertes Alexa-647-Aktin, unter Verwendung des Extinktionskoeffizienten von unmarkiertem Aktin, des Fluor-Korrekturfaktors von 0,03 und der folgenden Formel:
         
      4. Berechnen Sie das Prozentetikett von Alexa-647-Aktin unter Verwendung der für Alexa-647 ermittelten ε von 239.000 ^{M-1 cm-1} wie folgt:
         
   2. Tauen Sie ein 2-μl-Aliquot von 3 μM 100 % markiertem Biotin-Aktin (markiert auf Lysinresten) auf. 10-fach durch Zugabe von 18 μl G-Puffer verdünnen.
   3. Kombinieren Sie 3 μl verdünntes biotinyliertes Aktin und geeignete Volumina unmarkiertes und markiertes Aktin (oben), so dass die endgültige Mischung 12,5 μM Gesamtaktin mit 10 % bis 30 % fluoreszierender Markierung beträgt.
      Anmerkung: Ein Anteil von mehr als 30 % fluoreszierender Aktinmonomere (endgültig) kann die Bildauflösung beeinträchtigen, da Filamente vom Hintergrund schwer zu erkennen sind.
3. Bereiten Sie Reaktionsmischungen vor (Abbildung 1C).
   1. Bereiten Sie den Zytoskelett-Mix (Röhrchen A) vor, indem 2 μl des 12,5-μM-Aktin-Mixes (6.2.3) mit dem Tubulin-Stock-Mix (6.1.4) nicht länger als 15 Minuten vor der Bildgebung kombiniert werden. Bis zur Verwendung auf Eis lagern.
   2. Bereiten Sie eine Proteinreaktionsmischung (Tube B) vor, indem Sie alle anderen experimentellen Komponenten und Proteine kombinieren, einschließlich 2x TIRF-Puffer, Anti-Bleichmittel, Nukleotide, Puffer und akzessorische Proteine. Ein Beispiel ist in Abbildung 1C dargestellt.
      Anmerkung: Die abschließende Verdünnung führt zu einem 1x TIRF-Puffer, der ATP, GTP und Ionenstärke innerhalb des geschätzten physiologischen Bereichs enthält.
4. Röhrchen A und Röhrchen B getrennt bei 37 °C für 30-60 s inkubieren. Um die Reaktion zu starten, mischen Sie den Inhalt von Röhrchen B und fügen Sie es zu Röhrchen A (unten) hinzu.

>7. Bild-Aktin- und Mikrotubuli-Dynamik

1. Bedingungsbohrung für die Perfusion (Abbildung 1B; Schritt 4, oben).
2. Initiieren Sie die gleichzeitige Assemblierung von Aktin und Mikrotubuli, indem Sie den Inhalt von Röhrchen B (Reaktionsgemisch) zu Röhrchen A (Zytoskelett-Gemisch) hinzufügen (Abbildung 1C).
3. Fluss 50 μl der Reaktion mit 1x TIRF-Puffer, ergänzt mit 15 μM freiem Tubulin, 1 mM GTP und 0,5 μM Aktinmonomeren und entsprechenden Volumina von Pufferkontrollen.
4. Nehmen Sie Zeitrafferfilme mit der Mikroskopsoftware auf, um sie alle 5 s für 15-20 Minuten aufzunehmen
   Anmerkung: Die Initiierung der Aktin- und Mikrotubuli-Dynamik erfolgt innerhalb von 2-5 Minuten (Abbildung 2). Längere Verzögerungen deuten auf Probleme mit der Temperaturkontrolle oder konzentrationsbedingte Probleme von Proteinen im Reaktionsmix hin.
5. Konditionieren Sie eine neue Perfusionsvertiefung (Schritt 4) und ersetzen Sie das Puffervolumen durch regulatorische Proteine von Interesse (d. h. Tau) und Pufferkontrollen (Abbildung 1C). Erwerben Sie, wie in Schritt 7 (oben) beschrieben, um regulatorische Proteine für emergente Aktin-Mikrotubuli-Funktionen zu bewerten.

Ergebnisse

Abbildung 1. Experimentelle Schaltpläne: Montage der Durchflusskammer bis zur Bildaufnahme. (A) Montage der Bildgebungskammer. Von oben nach unten: Die IBIDI-Bildgebungskammern werden entlang der Perfusionsvertiefungen abgeklebt (gekennzeichnet durch einen Pfeil); Die zweite (weiße) Schicht des Klebebandes (in der Abbildung zur besseren Orientierung angelassen) wird entfernt und Epoxidharz wird am Rand der Perfus...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1% BSA (w/v)	Fisher Scientific	Artikel-Nr.: BP1600-100	Zu diesem Zweck (Blockieren von TIRF-Kammern) wird BSA in ddH20 resuspendiert und durch einen 0,22 μm Filter filtriert.
1× BRB80	selbstgemacht		80 mM ROHRE, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, pH 6,8 mit KOH
80 mM ROHRE, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, pH 6,8 mit KOH	Sigma Aldrich Inc., St. Louis, MO	Nr. G2133-50KU	Kombiniert mit Katalase, aliquot und bis zur Verwendung bei -80 oC lagern
100 μM Tubulin	Cytoskeleton Inc, Denver, CO	T240	Selbstgemachte Tubuline sollten vor der Verwendung recycelt werden, um polymerisationsinkompetentes Tubulin zu entfernen (Hyman et al. (1992)29; Li und Moore (2020)30 ). Im Handel erhältliche Tubuline sind oft zu verdünnt, um sie zu recyceln, funktionieren aber gut, wenn sie gemäß den Anweisungen des Herstellers resuspendiert und vor der Verwendung 60 Minuten lang durch Ultrazentrifugation (278.000 × g) vorgeklärt werden.
100 mM ATP	Gold Biotechnology Inc, Olivette, MO	Nr. A-08	Resuspendiert in ddH20 (pH 7,5) und filtersterilisiert.
100 mM GTP	Fisher Scientific	AC226250010	Resuspendiert in 1× BRB80 (pH 6,8) und filtersterilisiert.
120-150 mW Festkörperlaser	Leica Mikrosysteme	11889151; 11889148
2 mg/ml Katalase	Sigma Aldrich Inc., St. Louis, MO	C40-100	In Kombination mit Glukoseoxidase aliquotieren und bis zur Verwendung bei -80 oC lagern
2× TIRF-Puffer	Homemad		2× BRB80, 100 mM KCl, 20 mM DTT, 80 mM Glukose, 0,5 % (v/v) Methylcellulose (4.000 cp); Hinweis: 1 μl 0,1 M GTP und 1 μl 0,1 M ATP werden separat zu TIRF-Reaktionen hinzugefügt, um wiederholte Gefrier-Tau-Zyklen zu vermeiden.
24 × 60 mm, #1,5 Deckglas	Fisher Scientific, Waltham, MA	Tel.: 22-266882	Deckglas muss vor dem Gebrauch ausgiebig gewaschen werden (Smith et al. (2014)22 )
37 oC Heizblock
37 oC Wasserbad
5 mg/ml Streptavidin (600x Stamm)	Avantor, Philadelphia, PA	Artikel-Nr.: RLS000-01	Resuspendiert in Tris-HCl (pH 8,8); verdünnen Sie das Aliquot am Tag der Anwendung auf 1× in HEK-Puffer
5 min Epoxidharz und Härter	Loctite, Rocky Hill, Vereinigte Staaten von Amerika	1365736	Die Aushärtung von kombiniertem Harz und Härter kann bis zu 30 Minuten dauern.
50% biotinylierte GpCpp Mikrotubuli Samen	Zytoskelett Inc.; Selbstgemacht	T333P	(optional) GppCpp- oder Taxol-stabilisierte Mikrotubuli-Seeds können die Mikrotubuli-Polymerisation effizienter vermitteln. Taxol und GppCpp stabilisieren Mikrotubuli auf unterschiedliche Weise, was die Struktur des Mikrotubuli-Gitters und die Fähigkeit bestimmter regulatorischer Proteine, an den stabilisierten Teil des Mikrotubuli zu binden, beeinflussen kann. Eine Methode zur Herstellung verschiedener Arten von Mikrotubuli-Samen wird in Hyman et al. (1992) beschrieben.
70 C Inkubator
Aktin-Mix-Bestand	Hausgemacht; dieses Protokoll		Ein 12,5 μM Aktin-Mix, bestehend aus markiertem (fluoreszierendem und biotinyliertem) und unmarkiertem Aktin für bis zu sechs Reaktionen. 2 μl Stamm werden in der abschließenden TIRF-Reaktion verwendet. Die Endkonzentration des in jeder Reaktion verwendeten Aktins beträgt 0,5 μM (10 % Alexa-647; 0,09 % Biotin-markiert).
Geeignete Puffersteuerungen	selbstgemacht		Kombination von Puffern aus allen zu bewertenden Proteinen
Biotin-PEG-Silan (MW 3.400)	Laysan Bio Inc	Biotin-PEG-SIL-3400	In 2-5 mg Aliquote abgegeben, mit Stickstoff verfüllt, mit Parafilm verschlossen und bis zur Verwendung bei -20 °C mit Trockenmittel gelagert
Biotinyliertes Aktin	Zytoskelett Inc.; Selbstgemacht	AB07	Biotin-Aktin wird durch Markierung auf Lysinrückständen hergestellt und daher als mindestens 100% markiert angesehen, variiert jedoch je nach Charge/Zubereitung. Optimale biotinylierte Aktinkonzentrationen müssen für bestimmte Anwendungen/Versuchsdesigns empirisch bestimmt werden. Höhere Konzentrationen ermöglichen eine effizientere Nachverfolgung, können aber die Polymerisation oder Wechselwirkungen mit regulatorischen Proteinen behindern. Hier ist ein kleiner Prozentsatz (0,09 % oder 900 pM) biotinyliertes Aktin in der abschließenden TIRF-Reaktion vorhanden.
Spülmittel	Dawn, Procter and Gamble, Cincinnati, OH		Aus unbekannten Gründen reinigt die blaue Version Deckgläser effizienter als andere verfügbare Farben.
Trockeneis
Fluoreszenzmarkiertes Aktin	Zytoskelett Inc.; Selbstgemacht	AR05	Selbstgemachtes fluoreszenzmarkiertes Aktin wird in G-Puffer gelagert, der mit 50% Glycerin bei -20 °C ergänzt wird (Spudich et al. (1971) 47; Liu et al. (2022)48 ). Fluoreszenzmarkiertes Aktin wird vor der Verwendung gegen G-Puffer dialysiert und durch Ultrazentrifugation für 60 min bei 278.000 × g vorgeklärt.
Fluoreszenzmarkiertes Tubulin	Cytoskeleton Inc	TL488M, TLA590M, TL670M	Vor der Verwendung in 20 μL 1× BRB80 (10 μM Endkonzentration) resuspendiert und durch Ultrazentrifugation (278.000 × g) für 60 min vorgeklärt.
G-Puffer	selbstgemacht		3 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,2 mM CaCl2, 0,5 mM DTT, 0,2 mM ATP
HEK-Puffer	selbstgemacht		20 mM HEPES (pH 7,5), 1 mM EDTA (pH 8,0), 50 mM KCl
Eis
Eiskübel
Bildgebungskammer	IBIDI, Fitchburg, WI	Artikel-Nr.: 80666	Bestellen Sie Kammern ohne Boden, um verschiedene Deckglasbeschichtungen zu verwenden
iXon Life 897 EMCCD Kamera	Andor, Belfast, Nordirland	8114137
LASX Premium-Software für Mikroskope	Leica Mikrosysteme	8114137
Methylcellulose (4.000 cp)	Sigma Aldrich Inc	Nr. M0512
Mikroskopsockel mit TIRF-Modul ausgestattet	Leica Microsystems, Wetzlar, Deutschland	11889146
mPEG-Silan (MW 2.000)