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>1. Tägliches LLSM-Alignment durchführen
HINWEIS: (Wichtig) Dieses Ausrichtungsprotokoll basiert auf dem verwendeten LLSM-Instrument (siehe Materialtabelle). Jedes LLSM kann unterschiedlich sein und erfordert unterschiedliche Ausrichtungsstrategien, insbesondere solche, die selbst entwickelt werden. Führen Sie die entsprechende routinemäßige Ausrichtung durch und fahren Sie mit Abschnitt 2 fort.
- Geben Sie 10 mL Wasser plus 30 μl Fluorescein (1 mg/mL Stamm) in das LLSM-Bad (~10 mL Volumen), drücken Sie Image (Home), um das Objektiv an die Bildposition zu bewegen, und betrachten Sie ein einzelnes Bessel-Laserstrahlmuster. Richten Sie den Laserstrahl mithilfe der Hilfslinien und des voreingestellten Region of Interest (ROI) aus, um den Strahl zu einem dünnen Muster zu machen, das in alle Richtungen ausbalanciert ist.
- Der Strahl sollte auch in der Sucherkamera fokussiert erscheinen. Verwenden Sie zur Einstellung zwei Spiegelneigungsversteller, ein oberes Mikrometer, einen Fokus und einen Emissionsobjektivkragen. In Abbildung 1 A und B finden Sie den korrekt ausgerichteten Träger.
- Waschen Sie das Bad und die Objektive mit mindestens 200 ml Wasser, um das Fluorescein vollständig zu entfernen.
- Abbildung von fluoreszierenden Standardkügelchen in den Bildgebungsmedien (hergestellt durch Aufkleben von Kügelchen auf ein 5 mm Deckglas mit Poly-L-Lysin, siehe Materialtabelle; diese kann vorvorbereitet und wiederverwendet werden) für die physikalische Punktspreizfunktion (PSF) in bildgebenden Medien.
HINWEIS: Es kann nur eine Perle für die spätere Verarbeitung sichtbar sein, versuchen Sie also, eine Perle zu finden, die sich allein im Viewer befindet, oder die leicht zugeschnitten werden kann, um eine einzelne Perle zu erhalten.
- Schalten Sie Dither ein, indem Sie es im Feld "X Galvo-Bereich" auf 3 setzen. Drücken Sie Live, um das aktuelle Feld anzuzeigen. Bewegen Sie sich in Z-Richtung, um das Deckglas und die Perlen zu finden. Suchen Sie die Mitte einer Perle, indem Sie sich entlang Z bewegen, und drücken Sie Stopp, um den Laser anzuhalten. Aktivieren Sie 3D, drücken Sie Center und dann Ausführen. Dadurch werden die Daten gesammelt.
- Stellen Sie den Neigungsspiegel, den Objektivkragen und das Fokusmikrometer manuell auf die höchsten Grauwerte ein und passen Sie sie dann nach Bedarf an, um die richtigen Muster für die Aufnahmemodi Objektivscan, z galvo, z+objektiv (totPSF) und Probenscan (samplePSF) zu erhalten. Siehe Abbildung 1 C-F für ordnungsgemäß angepasste maximale Intensitätsprojektionen (MIPs).
Anmerkung: Die verschiedenen Aufnahmemodi (Objektiv-Scan, Z-Galvo, Z+Objektiv und Proben-Scan) ändern die Art und Weise, wie sich das Lichtblatt durch die Probe bewegt. Für die Ausrichtung sollten alle Scan-Modi verwendet werden.
- Der Beispielscan zeigt, wie die Daten während des Experiments gesammelt werden. Erfassen Sie die PSF-Stichprobe, indem Sie im Beispiel-Scan-Modus auf Ausführen drücken, um Entzerrung und Entfaltung zu ermöglichen. Ändern Sie den Laser in drei Farbmodi (488, 560, 647) und drücken Sie erneut Ausführen.
Anmerkung: Da die LLSM-Bilder in einem Winkel (57,2°) aufgenommen werden, werden Bilder, die im "Sample Scan"-Modus aufgenommen wurden, in diesem Winkel aufgenommen und sind daher "verzerrt". De-Skeling ist der Prozess der Korrektur dieses Winkels und der "Neuausrichtung" des Bildes auf einen echten Z-Stapel. Diese Daten müssen in bildgebenden Medien und in allen Kanälen gesammelt werden, die während des Experiments abgebildet werden. Wenn diese nicht ordnungsgemäß erfasst werden, werden die Daten nicht richtig entzerrt. Stellen Sie auf ähnliche Weise sicher, dass das Medium auf 37 °C (oder die gewünschte Versuchstemperatur) erwärmt wurde.
>2. Zellen mit LLSM einrichten
- Geben Sie 100.000 antigenpräsentierende Zellen (APCs) (50 μL) auf ein kreisförmiges Deckglas mit einem Durchmesser von 5 mm und lassen Sie sie 10 Minuten lang ruhen.
- Fetten Sie den Probenhalter ein und legen Sie dann das Deckglas mit der Küvettenseite nach oben darauf. Geben Sie einen Tropfen Bildmedium auf die Rückseite des Deckglases, um Blasen zu vermeiden, bevor Sie es in die Badewanne legen. Schrauben Sie den Probenhalter auf den Piezo und drücken Sie Bild (Home).
- Suchen Sie einen APC, um sicherzustellen, dass das LLSM und die Bildgebungssoftware (siehe Materialtabelle) ordnungsgemäß funktionieren.
Anmerkung: Wir bilden bei einer Schrittweite von 0,4 μm mit 60 Z-Schritten und 10 ms Belichtung für zwei Farben ab, wobei der Dither auf 3 eingestellt ist, was zu 1,54 s pro Frame des 3D-Bildes mit ~200 nm XY- und 400 nm Z-Auflösung führt. Diese Einstellungen müssen möglicherweise basierend auf der Zellgröße, der gewünschten z-Auflösung und der Stärke des Signals aus der verwendeten Fluoreszenzmarkierungstechnik angepasst werden. Der Verbrauch der Laserleistung hängt auch von der verwendeten Fluoreszenzmarkierungstechnik ab.
- Drücken Sie Live, um das aktuelle Bild anzuzeigen. Bewegen Sie sich entlang Z, um das Deckglas und die Zellen zu finden.
- Suchen Sie die Mitte eines APC, indem Sie sich in Z-Richtung bewegen, und drücken Sie dann Stopp, um den Laser anzuhalten. Aktivieren Sie 3D und geben Sie die gewünschten Einstellungen ein, drücken Sie Center und dann Ausführen. Dadurch werden die Daten gesammelt.
- Senken Sie den Tisch in die Ladeposition ab und geben Sie 50 μl T-Zellen in bildgebende Medien (100.000 Zellen) tropfenweise direkt über das Deckglas. Lassen Sie am besten einen Tropfen am Ende der Pipettenspitze entstehen und berühren Sie dann die Spitze mit der Badeflüssigkeit. Heben Sie die Bühne zurück, indem Sie auf "Bild (Zurück)" klicken.
- Beginnen Sie mit der Bildgebung. Stellen Sie sicher, dass Sie die gewünschte Stapelgröße und Zeitrafferlänge einstellen. Stellen Sie z. B. 60-Z-Stacks mit einer Schrittweite von 0,4 μm dar und geben Sie 500-Zeitrahmen ein. Beenden Sie (normalerweise) die Aufnahme, bevor 500 Bilder erreicht sind, um Photobleaching zu vermeiden. Verwenden Sie den Live-Modus, um nach Zellpaaren zu suchen, und wenn Sie die gewünschten Einstellungen eingegeben haben, drücken Sie Ausführen, um Daten zu erfassen. Ein Beispiel finden Sie in Abbildung 2.
