Interferenzreflexionsmikroskopie zur markierungsfreien Visualisierung der Mikrotubuli-Dynamik

Abstract

Quelle: Mahamdeh, M., et al. Implementierung der Interferenzreflexionsmikroskopie für die markierungsfreie Hochgeschwindigkeitsbildgebung von Mikrotubuli. J. Vis. Exp. (2019).

In diesem Video beschreiben wir die Technik der Interferenzreflexionsmikroskopie (IRM), um Mikrotubuli zu visualisieren, die auf einer Deckglasoberfläche in Gegenwart eines geeigneten Puffers wachsen. Bei Beleuchtung mit einfallendem Licht reflektieren die Deckglas-Puffer-Grenzfläche und die Puffer-Mikrotubuli-Grenzfläche Licht, das sich zu einem Interferenzmuster verbindet, das die Visualisierung von Mikrotubuli als kontrastreiche Bilder vor einem hellen Hintergrund ermöglicht.

Protocol

>1. Modifikation des Mikroskops und Objektiv

1. Setzen Sie mit einem entsprechenden Filterwürfel einen 50/50-Spiegel in das Filterrad des Fluoreszenzmikroskops ein (Abbildung 1). Behandeln Sie die 50/50 Spiegel mit Vorsicht, da sie oft entspiegelt sind.
   Anmerkung: Wir haben einen 50/50 Spiegel in einem leeren Filterwürfel des Mikroskops verwendet. Der 50/50-Spiegel wird dort eingesetzt, wo sich der dichroitische Spiegel befindet.
2. Verwenden Sie ein Ölobjektiv mit hoher Vergrößerung und hoher numerischer Apertur (NA).
   Anmerkung: In diesem Protokoll haben wir ein 100x/1,3 NA-Objektiv verwende....

Results

Abbildung 1. Schematische Darstellung von IRM. (A) Die Epi-Beleuchtung der Lichtquelle dringt durch die Aperturblende, bevor sie den 50/50-Spiegel erreicht. Die Aperturblende stellt die Strahlbreite und damit die Beleuchtung NA ein. Der 50/50-Spiegel reflektiert das Licht teilweise bis zum Objektiv, um die Probe zu beleuchten. Von der Probe reflektiertes Licht wird gesammelt und dann auf den Kamerachip (durch die Tubuslinse) proj.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mikroskop	Nikon	Ti-Eclipse	Ein inverses Mikroskop, das für die Durchführung der Exprimente verwendet wird
50/50 Strahlteiler	chroma	21000	Achten Sie beim Kauf darauf, die Splitterabmessungen zu wählen, die zu dem im Mikroskop verwendeten Würfel passen
NIKON PLAN FLUOR 100X/0,5-1,3 Iris-Objektiv	Nikon	MRH02902	Bildgebendes Objektiv. Dieses Ziel hat eine Blende zur Anpassung der NA, die auf NA 1.3 geöffnet wurde.
Mucasol Universalwaschmittel	Sigma-Aldrich	Z637181-2L	Wird zum Reinigen von Deckgläsern und Objektträgern verwendet
Paraffinfolie aus Kunststoff (Handelsname Parafilm M)	Sigma-Aldrich	Nr. P7793	Wird für den Bau von Strömungskanälen verwendet
Anti-TAMRA-Antikörper	Invitrogen	Nr. A-6397	Wird verwendet, um TAMRA-markierte Moleküle (z. B. Mikrotubuli) an die Probenoberfläche zu binden. RRID (AB_2536196)
Poloxamer 407 (Handelsname Pluronic F-127)	Sigma-Aldrich		Wird verwendet, um die Kanaloberfläche zu blockieren, um unspezifische Bindungen zu verhindern
40 nm Gold-Nanopartikel	Sigma-Aldrich	753637	Wird als Kontrollstichprobe verwendet
20 nm Gold-Nanopartikel	Sigma-Aldrich	Artikel-Nr.: 753610	Wird als Kontrollstichprobe verwendet
Zyla 4.2 Kamera	Andor	Zyla 4.2	2048x2048 Pixles (6,5μm Pixelgröße) mit Quanteneffizienz von 72% und 16bit Dynamikbereich
Feista Tracking-Software			https://www.bcube-dresden.de/ fiesta/wiki/FIESTA
Stabilisierte Mikrotubuli			Im Haus erstellt (siehe Referenzen im Text)