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>1. Modifikation des Mikroskops und Objektiv
- Setzen Sie mit einem entsprechenden Filterwürfel einen 50/50-Spiegel in das Filterrad des Fluoreszenzmikroskops ein (Abbildung 1). Behandeln Sie die 50/50 Spiegel mit Vorsicht, da sie oft entspiegelt sind.
Anmerkung: Wir haben einen 50/50 Spiegel in einem leeren Filterwürfel des Mikroskops verwendet. Der 50/50-Spiegel wird dort eingesetzt, wo sich der dichroitische Spiegel befindet.
- Verwenden Sie ein Ölobjektiv mit hoher Vergrößerung und hoher numerischer Apertur (NA).
Anmerkung: In diesem Protokoll haben wir ein 100x/1,3 NA-Objektiv verwendet.
>2. Vorbereitung der Kammer zum Anhaften von Mikrotubuli an der Oberfläche
- Reinigen Sie Objektträger und Deckgläser 22 mm x 22 mm (für aufrechte Mikroskope) oder 22 mm x 22 mm und 18 mm x 18 mm (für inverse Mikroskope). Ändern Sie die Oberfläche nach Bedarf. Reinigen Sie zum Beispiel die Deckgläser mit einem alkalischen Reinigungsmittel (siehe Materialtabelle), gefolgt von 100 % Ethanol mit destilliertem Wasser, das dazwischen und danach gewaschen wird.
- Schneiden Sie 3 mm breite Streifen aus Kunststoffparaffinfolie (siehe Materialtabelle) mit einer Rasierklinge und einem weiteren Objektträger als Kante ab.
- Legen Sie zwei Paraffinfolienstreifen aus Kunststoff im Abstand von 3 mm auf einen sauberen Deckglas von 22 x 22 mm. Legen Sie dann ein Deckglas 18 mm x 18 mm zu einem Kanal an. Wenn Sie ein aufrechtes Mikroskop verwenden, legen Sie die Streifen auf einen sauberen Objektträger und legen Sie dann ein Deckglas darauf.
- Legen Sie das Deckglas (oder die Folie) für 10-30 s bei 100 °C auf einen Heizblock, damit die Paraffinfolie einen versiegelten Kanal bildet.
- 50 μg/ml Antikörper (in Brinkley Buffer 1980 (BRB80)) durch Perfusion mit einer Pipette einfließen. 10 Min. inkubieren< />
Anmerkung: Wir verwenden Anti-Rhodamin-Antikörper, um Rhodamin-markierte Mikrotubuli-Samen an die Oberfläche zu binden. Alternativ kann Avidin verwendet werden, um Biotin-markierte Mikrotubuli-Samen oder an biotinylierte Goldpartikel zu binden. Um Mikrotubuli in Abwesenheit von Tubulin in Lösung einfach zu betrachten (d. h. ein nicht-dynamischer Assay), kann ein Anti-Tubulin-Antikörper verwendet werden.
- Fünfmal mit BRB80 Puffer waschen. Es wird empfohlen, die Lösungen mit einem 0,22 μm Filter zu filtrieren.
- 1 % Poloxamer 407 (ein Triblock-Copolymer) in BRB80 einfließen lassen, um die Oberfläche gegen die unspezifische Bindung zu blockieren. 10 Min. inkubieren.
- Fünfmal mit BRB80 Puffer waschen.
- Die Probe ist bereit, auf das Mikroskop gelegt zu werden. Um ein Austrocknen der Probe zu verhindern, fügen Sie zwei Tröpfchen BRB80-Puffer an den Enden des Kanals hinzu und füllen Sie sie bei Bedarf auf.
>3. Ausrichtung des Mikroskops
- Legen Sie die Probe auf den Mikroskoptisch. Schalten Sie die epi-illumination-Lichtquelle ein.
- Fokussieren Sie sich auf die Probenoberfläche. Sie werden mehrere Oberflächen beobachten, während das Objektiv aufgrund der Rückreflexion des Lichts von der Optik innerhalb des Strahlengangs auf und ab bewegt wird. Eine gute Methode, um die Probenoberfläche zu finden, besteht darin, sich auf den Rand des Paraffinfilms zu fokussieren. Sobald die Oberfläche gefunden ist, stellen Sie das Sichtfeld auf die Mitte der Kammer ein.
- Zentrieren Sie die Bildfeldblende im Gesichtsfeld, indem Sie sie halb schließen und die Einstellschrauben verwenden. Sobald sie ausgerichtet ist, öffnen Sie die Membran wieder.
Anmerkung: Die Schraubeneinstellung muss nur sporadisch, vielleicht alle 3-6 Monate oder bei der Fehlerbehebung durchgeführt werden.
- Schieben Sie die Bertrand-Linse ein, um die Austrittspupille (hintere Brennebene) des Objektivs zu betrachten.
- Schließen Sie die Aperturblende (AD) über die Ränder der Austrittspupille des Objektivs hinaus.
- Verwenden Sie die Einstellschrauben, um das AD mit der Austrittspupille zu zentrieren. Überprüfen Sie dies erneut, indem Sie das AD öffnen und seine Kanten mit denen der Austrittspupille abgleichen.
Anmerkung: Diese Anpassung muss nur sporadisch vorgenommen werden.
- Stellen Sie die Aperturblende auf etwa 2/3 der NA des Objektivs ein.
>4. Bildgebend stabilisierte Mikrotubuli oder 40 nm Goldpartikel
HINWEIS: Stabilisierte Mikrotubuli und Goldnanopartikel dienen als gute Kontrollproben. Es wird empfohlen, oberflächengebundene Mikrotubuli oder Goldnanopartikel als ersten Schritt abzubilden, um die IRM-Leistung zu beurteilen und die optimale Öffnung der Aperturblende einzustellen (Abschnitt 7).
- Stellen Sie die Belichtungszeit der Kamera auf 10 ms ein und passen Sie die Beleuchtung so an, dass der Dynamikbereich der Kamera nahezu gesättigt ist.
- 10 μl Guanylyl-(alpha)-methylen-diphosphonat (GMPCCP)- oder Taxol-stabilisierte Mikrotubuli in BRB80 (oder 40 nm Goldpartikeln) durch Perfusion mit einer Pipette in eine frische Probe einfließen lassen und die Bindung durch Abbildung der Oberfläche überwachen. Sobald 10-20 Mikrotubuli im Sichtfeld gebunden sind, waschen Sie die Probe 2x mit BRB80.
Anmerkung: Mit einem gut ausgerichteten Mikroskop sollten die Mikrotubuli ohne Hintergrundsubtraktion sichtbar sein.
- Nehmen Sie 10 Bilder auf, indem Sie einen Zeitraffer mit 1 Sekunde Verzögerungszeit für 10 Sekunden (bei 10 ms Belichtungszeit) einstellen.
- Erfassen Sie ein Hintergrundbild. Bewegen Sie dazu den Tisch mit dem Tischregler oder der Computersoftware entlang der Kanallangachse, während Sie 100 Bilder ohne Verzögerung aufnehmen (d. h. Streaming mit fast 100 fps @ 10 ms Belichtung).
Anmerkung: Der Hintergrund ist der Median der 100 Bilder. Durch die Aufnahme des Medians bleiben das Beleuchtungsprofil und andere stationäre Merkmale wie Schmutz auf der Optik erhalten, während alles andere herausgefiltert wird. Es sollte keine Neigung der Probe geben, da dies zu einer Änderung der axialen Position führt, wenn der Tisch bewegt wird, und letztendlich das Hintergrundbild verschlechtert. Wenn die Neigung nicht vermieden werden kann, besteht eine alternative Methode darin, gemittelte Hintergrundbilder zu erfassen, bevor die Samen fließen .
- Um die Bilder zu verarbeiten und zu analysieren, fahren Sie mit Schritt 6 fort.
>5. Abbildung der Dynamik von Mikrotubuli
- Für die Mikrotubuli-Dynamik mit Gehirntubulin stellen Sie die Temperatur der Probenheizung auf 37 °C ein.
- Fließen Sie 10 μl GMPCCP-stabilisierte Mikrotubuli-Seeds in BRB80 durch Perfusion mit einer Pipette in eine frische Probe ein und überwachen Sie deren Bindung an die Oberfläche, indem Sie die Oberfläche live abbilden (d. h. während des Streamens). Sobald 10-20 Samen mit dem Sichtfeld gebunden sind, waschen Sie die Probe mit 2x Kanalvolumen mit BRB80 (BRB80 sollte auf 37 °C oder mindestens bei Raumtemperatur vorgewärmt werden).
Anmerkung: Mit einem gut ausgerichteten Mikroskop sollten die Seeds ohne Hintergrundsubtraktion sichtbar sein.
- Strömung in der Polymerisationsmischung (7,5 μM unmarkiertes Tubulin + 1 mM Guanosintriphosphat (GTP) + 1 mM Dithiothreitol (DTT) in BRB80-Puffer). Um das Wachstum der Mikrotubuli zu messen, stellen Sie mit der Erfassungssoftware einen Zeitraffer ein, um 15 Minuten lang alle 5 Sekunden (0,2 Bilder pro Sekunde (fps)) ein Bild aufzunehmen.
- Um den Kontrast zu erhöhen, nehmen Sie zu jedem Zeitpunkt 10 Bilder (statt einem) auf und mitteln Sie sie. Für die Schrumpfung der Mikrotubuli nehmen Sie Bilder mit 100 Bildern pro Sekunde auf, indem Sie die Zeitverzögerung auf 0 und eine Belichtungszeit von 10 ms einstellen (je nach verwendeter Kamera sind höhere Bilder mit kleineren Interessenbereichen möglich).
- Erfassen Sie ein Hintergrundbild wie in Schritt 4.4.
>6. Bildverarbeitung und -analyse
HINWEIS: Für die Analyse verwendet dieses Protokoll Fidschi, aber dem Leser steht es frei, jede Software zu verwenden, die er/sie für geeignet hält.
- Öffnen Sie gespeicherte Hintergrundbilder.
- Berechnen Sie das mittlere Bild (d. h. den Hintergrund) mit dem Projekt "Bild" > "Stapel > Z" > "Median".
- Öffnen Sie den Mikrotubuli-Dynamikfilm als Stapel (wie bei nicht-dynamischen Mikrotubuli) mit Datei > Öffnen.
- Subtrahieren Sie das Hintergrundbild vom Stapel mit dem Prozess- > Bildrechner. Stellen Sie sicher, dass Sie die Option "32bit (float) result" aktivieren.
- Zeichnen Sie bei dynamischen Mikrotubuli mit dem Linienwerkzeug eine Linie entlang des interessierenden Mikrotubuli und fügen Sie sie dem Manager für den interessierenden Bereich hinzu, indem Sie "t" drücken. Wiederholen Sie dies für alle Mikrotubuli von Interesse.
- Führen Sie für dynamische Mikrotubuli das Multi-Kymo-Makro aus. Das Makro generiert ein Video und einen Kymographen für jeden Mikrotubuli im ROI-Manager. Jeder Mikrotubuli erhält eine eindeutige Kennung.
- Führen Sie für dynamische Mikrotubuli das Kymo-Analyse-Makro aus und befolgen Sie die Schritte, um die Wachstums- und Schrumpfungsraten der Mikrotubuli zu messen.
>7. Größe der Aperturblende
HINWEIS: Ein wichtiger Faktor für die Aufnahme von kontrastreichen Bildern von Mikrotubuli mit IRM ist die korrekte Einstellung der numerischen Apertur (INA) der Beleuchtung. Die INA kann geändert werden, indem die Größe des einfallenden Beleuchtungsstrahls an der Austrittspupille des Objektivs geändert wird, die durch die Größe des AD gesteuert wird (die AD befindet sich in einer konjugierten Ebene mit der Austrittspupille (hintere Brennebene) des Objektivs, Abbildung 1):
wobei DAD der Durchmesser der Aperturblende, dasf-Objektiv die Brennweite des Objektivs und Dep der Austrittspupillendurchmesser des Objektivs ist. In der Regel wird die AD für die Fluoreszenzbildgebung vollständig offen gelassen, so dass die INA der NA des Objektivs entspricht. In einem Fluoreszenzmikroskop zeigt die AD-Skala nicht den Durchmesser an, so dass die INA nicht berechnet werden kann. Es ist möglich, die AD-Größe mit Hilfe eines Objektivs zu kalibrieren. Dies ist jedoch nicht erforderlich, da die AD-Größe auf die Größe festgelegt ist, die den höchsten Kontrast erzeugt.
- Bereiten Sie eine Probe von fluoreszenzmarkierten, stabilisierten Mikrotubuli vor, die an der Oberfläche haften (Schritte 4.1-4.2).
Anmerkung: Wir verwendeten mit Tetramethylrhodamin markierte Mikrotubuli (Bsp.: 550 nm, Em: 580 nm).
- Bringen Sie die Mikrotubuli mit dem Fokussierknopf des Mikroskops in den Fokussierknopf, während Sie sie fluoreszierend abbilden (wenn die Mikrotubuli nicht markiert sind, bilden Sie sie mit IRM oder DIC ab).
- Stellen Sie die Kamerabelichtung mit der Kamerasoftware auf 10 ms ein.
Anmerkung: Diese Belichtung ist willkürlich und eine Belichtung von 100 ms würde auch funktionieren.
- Schließen Sie das AD bis zur kleinsten Öffnung. Stellen Sie die Beleuchtung so ein, dass sie den Dynamikbereich der Kamera nahezu sättigen oder auf das maximal mögliche Niveau bringt.
Anmerkung: Verwenden Sie als Leitfaden die Nachschlagetabelle, die in der Regel von der Akquisitionssoftware bereitgestellt wird.
- Erfassen Sie 10 Bilder (durch Streaming oder Aufnehmen eines Bildes pro Sekunde) eines Sichtfelds mit 10+ Mikrotubuli.
- Erfassen Sie ein Hintergrundbild wie in Schritt 4.4.
- Ändern Sie die Größe des AD und wiederholen Sie die Schritte 7.5-7.6 für den gesamten AD-Öffnungsbereich (von geschlossen bis zur Größe der Austrittspupille, Abbildung 2). Jedes Mal, wenn die AD-Größe geändert wird, passen Sie die Beleuchtungsstärke an die von Schritt 7.4 an.
- Subtrahieren Sie für jedes aufgenommene Sichtfeld den entsprechenden Hintergrund mit dem Bildrechner > Prozess und wählen Sie "Subtrahieren" aus dem Dropdown-Menü. Stellen Sie sicher, dass die Option "32bit (float) result" aktiviert ist. Mitteln Sie dann die resultierenden Bilder mit Bild > Stapel > Z-Projekt> Mittelwert.
- Messen Sie das Signal-zu-Hintergrund-Rauschverhältnis (SBR) der Mikrotubuli, definiert als die durchschnittliche Intensität des Mikrotubuli-Signals (Intensität des Mikrotubuli minus die Intensität des Hintergrunds) dividiert durch die Standardabweichung des Hintergrunds (Abbildung 3).
- Bestimmen Sie die optimale AD-Größe (d. h. optimale INA), indem Sie die durchschnittliche SBR der Mikrotubuli für jede Öffnungsgröße berechnen und die AD-Größe auf diejenige einstellen, die die höchste SBR erzeugt (Abbildung 2). Es ist möglich, dass es eine Reihe von AD-Größen gibt, die einen vergleichbaren Kontrast erzeugen.
