Statische Rasterkraftmikroskopie zur Visualisierung und Charakterisierung von zusammengesetzten Nukleosomen

Zusammenfassung

Quelle: Stormberg, T., et al. Sondierung der Struktur und Dynamik von Nukleosomen mit Hilfe der Rasterkraftmikroskopie. J. Vis. Exp.(2019)

In diesem Video demonstrieren wir statische Rasterkraftmikroskopie, um zusammengesetzte Nukleosomen zu visualisieren. Dieses hochauflösende bildgebende Verfahren ermöglicht die Untersuchung der Nukleosomenstruktur.

Protokoll

>1. Funktionalisierung der Glimmeroberfläche für die statische AFM-Bildgebung von Nukleosomen

1. Bereiten Sie eine 50 mM 1-(3-Aminopropyl) Silatran APS-Stammlösung in deionisiertem Wasser wie beschrieben vor. 1 ml Aliquots dieser Lösung bis zur Verwendung bei 4 °C lagern.
   Anmerkung: Die Aliquote können mehr als ein Jahr bei 4 °C gelagert werden.
2. Bereiten Sie eine funktionierende APS 1:300-Lösung für die Glimmermodifikation vor, indem Sie 50 μL des 50 mM APS-Stammes in 15 mL dd_{H 2}O.
   Anmerkung: Diese Arbeitslösung kann mehrere Tage bei Raumtemperatur gelagert werden.
3. Schneiden Sie 1 x 3 cm große Glimmerstreifen aus hochwertigen Glimmerplatten ab (siehe hier Materialtabelle für verwendeten Glimmer).
   1. Prüfen Sie, ob das Stück passt, wenn es diagonal in eine Küvette gelegt wird. Verwenden Sie die Spitze einer scharfen Pinzette, einer Rasierklinge oder Klebeband, um Schichten des Glimmers zu spalten, bis beide Seiten frisch gespalten sind und das Stück so dünn wie ~0,1 mm ist (Abbildung 1A). Legen Sie das Glimmerstück sofort in die mit APS gefüllte Küvette und inkubieren Sie es 30 Minuten lang (Abbildung 1B).
4. Das Glimmerstück in eine mit dd H2O gefüllte Küvette geben und 30 s einweichen lassen (Abbildung 1C). Trocknen Sie den APS-Glimmerstreifen beidseitig unter Argonströmung vollständig ab.
   Anmerkung: Ein Reinraumtuch aus Vliesstoff aus Zellulose und Polyester (empfohlenes Tuch mit detaillierten Angaben in den Materialien) kann verwendet werden, um das Wasser beim Trocknen vom Rand des Glimmers abzuleiten.
5. Verwenden Sie nun den trockenen Glimmerstreifen für die Probenvorbereitung. Andernfalls lagern Sie das Stück in einer sauberen, trockenen Küvette (Abbildung 1D).
   Anmerkung: Eine zusätzliche Lagerung im Vakuum für 1-2 Stunden wird empfohlen, wenn die Umgebung feucht ist. Das Protokoll kann hier pausiert werden.

>2. Vorbereitung von Nukleosomenproben auf APS-Glimmer für die statische AFM-Bildgebung

1. Kleben Sie doppelseitiges Klebeband auf mehrere magnetische Pucks und legen Sie diese zur Seite.
2. Schneiden Sie das APS-Glimmer-Substrat auf die gewünschte Größe zu (1 x 1 cm Quadrate für das hier verwendete MM AFM-Instrument). Legen Sie diese Stücke in eine saubere Petrischale und bewahren Sie sie abgedeckt auf.
3. Bereiten Sie drei Verdünnungen der assemblierten Nukleosomen (Endnukleosomenkonzentrationen von 0,5, 1,0 und 2,0 nM) unter Verwendung eines 0,22 μm filtrierten Puffers vor, der 10 mM HEPES pH 7,5 und 4 mM MgCl₂,
   Anmerkung: Um den Verlust von Nukleosomen bei niedriger Endkonzentration zu begrenzen, sollten die Verdünnungen nacheinander unmittelbar vor der Abscheidung auf dem APS-Glimmer erfolgen.
4. Geben Sie 5-10 μl der verdünnten Nukleosomenprobe in die Mitte des APS-Glimmerstücks und lassen Sie es zwei Minuten lang inkubieren. Spülen Sie die Probe vorsichtig mit 2-3 mL dd H₂O, um alle Pufferkomponenten zu entfernen. Nachdem jeweils ~0,5 ml dd H₂O verwendet wurden, schütteln Sie den Glimmer vorsichtig, um das überschüssige Spülwasser zu entfernen.
   Anmerkung: Für diesen Spülschritt wird eine Einmalspritze empfohlen.
5. Die abgelagerte Probe wird unter einem leichten Strom von sauberem Argongas getrocknet.
   Anmerkung: Die Probe ist nun bereit für die Abbildung oder kann in einem mit Argon gefüllten Vakuumschrank oder Exsikkator gelagert werden. Proben, die wie beschrieben vorbereitet und gelagert wurden, wurden ein Jahr nach der Aufbereitung ohne Qualitätsverlust abgebildet. Das Protokoll kann hier pausiert werden.

>3. Statische AFM-Bildgebung von Nukleosomen

1. Montieren Sie eine AFM-Spitze auf dem Spitzenhalter. Verwenden Sie eine Spitze mit einer Federkonstante von ~40 N/m und einer Resonanzfrequenz zwischen 300 und 340 kHz (siehe Materialtabelle für die hier verwendeten Ausleger).
2. Montieren Sie die in Abschnitt 3 vorbereitete Probe auf dem AFM-Tisch und achten Sie darauf, die Probenoberfläche nicht zu berühren.
3. Positionieren Sie den Laser über dem Ausleger, bis die Summe maximal ist, und stellen Sie die Werte für vertikale und seitliche Ablenkung auf nahe Null ein.
4. Stimmen Sie die AFM-Sonde so ab, dass sie ihre Resonanzfrequenz ermittelt, passen Sie die Antriebsamplitude an und stellen Sie die Bildgröße auf 100 x 100 nm ein. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Aktivieren", um die Annäherung zu starten.
5. Optimieren Sie nach der Annäherung den Amplitudensollwert schrittweise, bis die Oberfläche der Probe deutlich zu sehen ist. Erhöhen Sie die Scangröße auf 1 x 1 μm und die Auflösung auf 512 x 512 Pixel. Klicken Sie auf die Aufnahmeschaltfläche und dann auf die Schaltfläche "Aktivieren", um die Bildaufnahme zu starten.
   Anmerkung: Die Bilder in Abbildung 2 zeigen den glatten Hintergrund, der bei der Abbildung dieser Proben zu erwarten ist.

Ergebnisse

Abbildung 1: Schematische Darstellung des Prozesses zur Präparation von APS-funktionalisiertem Glimmer für die AFM-Bildgebung von Nukleosomen. (A) Bei einem Stück Glimmer mit einer Dicke von ~0,1 mm wurden beide Seiten frisch gespalten. (B) Das gespaltene Glimmerstück wird sofort diagonal in eine Küvette gelegt, die die APS-Lösung enthält, und für 30 Minuten inkubiert. (C) Nach dem APS-Funktionalisierungsschritt ...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
CENP-A/H4)2, rekombinant human	EpiCypher, Durham, NC	Tel.: 16-0010	Katalognummer für 50 ug
H2A/H2B, rekombinant human	EpiCypher, Durham, NC	Tel.: 15-0311	Katalognummer für 50 ug
H3 Octamer, rekombinanter Mensch	EpiCypher, Durham, NC	Tel.: 16-0001	Katalognummer für 50 ug
Slide-A-Lyzer MINI Dialysegeräte-Kit, 10K MWCO, 0,1 mL	ThermoFischer Scientific, Waltham, MA	Artikel-Nr.: 69574	Katalognummer für 10 Geräte
Natriumchlorid	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	Nr. S9888-500G	Katalognummer für 500 mg
Amicon Ultra-0,5 mL Zentrifugalfilter	Millipore-sigma, Burlington, MO	UFC501008	Katalognummer für 8 Geräte
hcl	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	Artikel-Nr.: 258148-25ML	Katalognummer für 25 mL
Tricin	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	T0377-25G	Katalognummer für 25 g
Sds	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	11667289001	Katalognummer für 1 kg
Ammoniumpersulfat (AmmPS)	Bio-Rad, Hercules, Kalifornien	Artikel-Nr.: 1610700	Katalognummer für 10 g
30% Acrylamid/Bis-Lösung, 37,5:1	Bio-Rad, Hercules, Kalifornien	1610158	Katalognummer für 500 mL
TEMED	Bio-Rad, Hercules, Kalifornien	Artikel-Nr.: 1610800	Katalognummer für 5 mL
4x Laemmli Protein-Probenpuffer für SDS-PAGE	Bio-Rad, Hercules, Kalifornien	1610747	Katalognummer für 10 mL
2-ME	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	M6250-10ML	Katalognummer für 10 mL
ageRuler Leiter für vorgefärbte Proteine	ThermoFischer Scientific, Waltham, MA	Artikel-Nr.: 26616	Katalognummer für 500 μl
Bio-Safe™ Coomassie Beize	Bio-Rad, Hercules, Kalifornien	1610786	Katalognummer für 1 L
Vliesstoff-Tücher für Reinräume: TX604 TechniCloth	TexWipe, Kernersvile, NC	TX604
Muskovit Block Glimmer	AshevilleMica, Newport News, VA	Klasse-1
HEPES	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	H4034-25G	Katalognummer für 25 g
Tesafilm	Scotch-3M, St. Paul, MN
TESPA-V2 AFM-Sonde (für statische Bildgebung)	Bruker AFM-Sonden, Camarillo, Kalifornien
Millex-GP Filter, 0,22 μm	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	SLGP05010	Katalognummer für 10 Geräte
BL-AC10DS-A2 AFM-Sonde (für HS-AFM)	Olympus, Japan
MultiMode-Rasterkraftmikroskop	Bruker-Nano/Veeco, Santa Barbara, Kalifornien