Hochgeschwindigkeits-Zeitraffer-Rasterkraftmikroskopie zur Erfassung der Nukleosomendynamik

Zusammenfassung

Quelle: Stumme-Diers, M. P., et al., Sondierung der Struktur und Dynamik von Nukleosomen mit Hilfe der Rasterkraftmikroskopie.J. Vis. Exp.(2019)

In diesem Video demonstrieren wir Hochgeschwindigkeits-Zeitraffer-Rasterkraftmikroskopie, AFM und bildgebende Techniken, um die Dynamik von Nukleosomenkomplexen zu untersuchen. Während die AFM-Spitze über die Oberfläche des Nukleosoms scannt, erkennt sie Veränderungen in der Nukleosomenhöhe und zeichnet die DNA-Enthüllung im Laufe der Zeit auf.

Protokoll

>1. Kontinuierliche Verdünnungsanordnung von Mononukleosomen

1. Erzeugung und Aufreinigung eines ca. 400 bp großen DNA-Substrats, das eine dezentrierte Widom 601 Nukleosomen-Positionierungssequenz enthält.
   Anmerkung: Um die unerwünschte Bildung von Dinukleosomen zu begrenzen, sollte jeder "Arm", der die Positionierungssequenz flankiert, ~150 bp nicht überschreiten.
   1. Verwenden Sie das Plasmid pGEM3Z-601 zusammen mit den designten Primern und amplifizieren Sie die Substrat-DNA mittels PCR. Für das hier verwendete 423 bp Substrat mit 122 und 154 bp Armlängen verwenden Sie Vorwärts- (5'-CAGTGAATTGTAATACGACTC-3') und Rückwärts (5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3') Grundierungen.
   2. Die Röhrchen mit dem Reaktionsgemisch werden in einen auf 95 ΰC vorgeheizten Thermocycler gegeben. Nach einer anfänglichen Denaturierung für 5 Minuten bei 95 °C wird das folgende Programm für 33 Zyklen durchgeführt: 30 s Denaturierung bei 95 °C, 30 s Glühen bei 49 °C und 35 s Verlängern bei 72 °C. Nach den 33 Zyklen wird eine abschließende Verlängerung auf 72 °C für 10 min eingestellt.
   3. Reinigen Sie die DNA aus dem PCR-Gemisch mit einem handelsüblichen PCR-Aufreinigungskit. Bei der Eluierung der DNA aus der PCR-Aufreinigungssäule verwenden Sie 10 mM Tris-Puffer (pH 7,5) anstelle des im Kit bereitgestellten Elutionspuffers.
      Anmerkung: Achten Sie besonders darauf, dass keine Puffer zwischen den Reinigungsschritten übertragen werden. Ein kontaminierter Eluent kann nachgeschaltete Probleme bei der Messung der DNA-Konzentration verursachen und/oder die Ausgangssalzkonzentration der Nukleosomenassemblierungsmischung verändern.
2. Bestimmen Sie die DNA-Konzentration, indem Sie die Absorption der gereinigten DNA bei 260 nm messen.
   1. Sammeln Sie eine Leerprobe auf dem UV-VIS-Spektralphotometer nur mit dem 10 mM Tris pH 7,5 Elutionspuffer. Entnehmen Sie eine Messung der gereinigten DNA.
3. Wenn die Konzentration bestimmt ist, aliquotieren Sie 25 pmol der gereinigten DNA in ein 0,6 mL Mikrofuge-Röhrchen und legen Sie es in eine Vakuumzentrifuge, bis die Lösung kaum noch sichtbar ist; dies sind typischerweise 30 min bis 1 h.
   Anmerkung: Das DNA-Substrat ist nun bereit für den Nukleosomenbau. Andernfalls kann hier das Protokoll pausiert und die DNA bis zur Verwendung bei -20 °C gelagert werden.
4. Legen Sie das Mikrofuge-Röhrchen mit der 25-pmol-DNA auf das Eis und fügen Sie die Nukleosomen-Assemblierungskomponenten in Tabelle 1 in der aufgeführten Reihenfolge hinzu. Wenn alle Komponenten hinzugefügt wurden, die Mischung aus dem Eis nehmen und bei Raumtemperatur (RT) 30 Min. inkubieren
   Anmerkung: Es ist von entscheidender Bedeutung, dass der Salzgehalt des Stammhistonpuffers bei der Berechnung des NaCl berücksichtigt wird, das zum Erreichen der Endkonzentration von 2 M erforderlich ist.
5. Assemblieren Sie die Nukleosomen, indem Sie die Salzkonzentration des Gemischs von 2 M durch eine kontinuierliche Verdünnung auf 200 mM reduzieren.
   1. Füllen Sie eine Spritze mit 100 μl Verdünnungspuffer mit 10 mM Tris pH 7,5 und legen Sie sie auf eine Spritzenpumpe.
   2. Führen Sie die Nadel der Spritze durch ein vorpunktiertes Loch in der Kappe des Mikrofuge-Röhrchens und stellen Sie sicher, dass der Kontakt mit der Montagemischung hergestellt wird (Abbildung 1).
   3. Lassen Sie die Spritzenpumpe 120 Minuten lang mit einer Geschwindigkeit von 0,75 μl/min laufen< > Anmerkung: Die resultierende 100 μL Lösung enthält 250 nM Nukleosomen und 200 mM NaCl.
   4. Übertragen Sie die Mischung auf einen 10 K MWCO-Dialyseknopf und dialysieren Sie 1 Stunde lang bei 4 °C gegen 200 ml eines vorgekühlten (4 °C) Puffers mit niedrigem Salzgehalt, der 10 mM Tris pH 7,5, 0,25 mM EDTA und 2,5 mM NaCl enthält.
6. Um den Histongehalt der Nukleosomenanordnung zu bestimmen, stellen Sie ein diskontinuierliches SDS-PAGE-Gel mit einer Trennung von 15 % und einer Stapelung von 6 % her, wie zuvor beschrieben.
   1. Aliquotieren Sie 10 - 20 μL des Nukleosomenbestands in ein Mikrofugeröhrchen und geben Sie 4x Laemmli Sample Buffer zu einer Arbeitskonzentration von 1 - 2x hinzu.
   2. Zur Kontrolle wiederholen Sie diese Zubereitung in einem separaten Mikrofuge-Röhrchen für 1 - 2 μg des Histon-Stammes. Erhitzen Sie die Proben auf 95 °C für ~ 5 min.
   3. Laden Sie die Proben in benachbarten Bahnen zueinander auf das Gel. Fügen Sie den ungenutzten Lanes einen Sample-Puffer hinzu, um eine gleichmäßige Bandenmigration zu fördern.
   4. Lassen Sie das Gel bei 65 V laufen, bis sich die Farbstofffront durch das Stapelgel bewegt. Wenn das Trenngel erreicht ist, erhöhen Sie es auf 150 V und lassen Sie es laufen, bis die Farbstofffront vollständig aus dem Gel migriert ist.
   5. Demontieren Sie die Elektrophoreseeinheit und geben Sie das Gel vorsichtig in einen mit dd H₂O gefüllten Färbebehälter. Lassen Sie das Gel 5 Minuten lang unter leichtem Rühren einwirken. Diesen Vorgang noch zweimal wiederholen, wobei jeweils frisches dd H₂O verwendet wird.
      Anmerkung: Der in diesem Protokoll verwendete Coomassie-Fleck erfordert nicht die typischen Fixierschritte, die für Coomassie-Flecken erforderlich sind (siehe Materialtabelle). Wenn ein anderes Coomassie-Präparat verwendet wird, passen Sie die Fixierschritte nach Bedarf an.
   6. Entfernen Sie das Wasser aus der letzten Spülung und fügen Sie gerade so viel Fleck hinzu, dass das Gel bedeckt ist. Lassen Sie das Gel unter leichtem Rühren mindestens 1 h.
      einwirken Anmerkung: Für das Rühren kann der Färbebehälter auf ein beliebiges Gerät gestellt werden, das die Bewegung des Flecks über das Gel fördert und gleichzeitig das Gel mit Flüssigkeit bedeckt hält.
   7. Entfernen Sie den Fleck aus dem Behälter und spülen Sie das Gel mit dd H₂O aus. Ersetzen Sie das dd H₂O und weichen Sie das Gel 30 Minuten lang unter leichtem Rühren ein. (Das Gel sollte wie in Abbildung 2 dargestellt aussehen, mit klarer Trennung der Histonbanden.)
7. Lagern Sie die Nukleosomen bis zur Verwendung bei 4 °C.
   Anmerkung: Bei dieser Lagerung bleiben Nukleosomen mehrere Monate lang stabil. Das Protokoll kann hier pausiert werden.

>2. Hochgeschwindigkeits-Zeitraffer-AFM-Bildgebung der Nukleosomendynamik

HINWEIS: Das folgende Protokoll wurde für das HS-AFM-Instrument bereitgestellt, das von der Ando-Gruppe (Kanazawa University, Kanazawa, Japan) entwickelt wurde.

1. Bereiten Sie APS-Glimmer für die Flüssigbildgebung vor.
   1. Befestigen Sie den Glasstab mit dem Glasstab-Scanner-Kleber am AFM-Scannertisch (siehe Materialtabelle). Lassen Sie dies mindestens 10 Minuten trocknen.
   2. Stelle ~0,1 mm dicke kreisförmige Glimmerstücke mit einem Durchmesser von 1,5 mm her, indem du sie aus einer größeren Glimmerplatte stanzt. Verwenden Sie den HS-AFM Glimmer-Glasstabkleber (siehe Materialtabelle), um dieses Glimmerstück an den Glasstab des HS-AFM zu befestigen und trocknen Sie es mindestens 10 Minuten lang unberührt. Spalten Sie die Schichten mit einem druckempfindlichen Klebeband, bis eine gut gespaltene Schicht auf dem Klebeband zu sehen ist.
   3. 1 μl 50 mM APS-Material wird in 99 μl dd H₂O verdünnt, um eine 500 μM APS-Lösung herzustellen. 2,5 μL dieser Lösung auf die frisch gespaltene Glimmeroberfläche geben und 30 Min. funktionalisieren lassen
      Anmerkung: Um ein Austrocknen der Oberfläche während des Funktionalisierens zu verhindern, kann die Kappe eines konischen 50-mL-Zentrifugenröhrchens mit einem feuchten Stück Filterpapier aufgesetzt und über den Scanner gestülpt werden. Der APS-Vorrat wird für die Flüssigkeitsbildgebung 3-mal weniger verdünnt als für die statische Bildgebung, um die Dynamik auf eine Rate zu steuern, die mit AFM beobachtet werden kann.
   4. Spülen Sie den Glimmer mit 20 μl dd H₂O aus, indem Sie mehrere ~3 μl Spülungen durchführen. Entfernen Sie das Wasser nach jedem Spülen vollständig, indem Sie ein Vliestuch an den Rand des Glimmers legen. Geben Sie nach der letzten Spülung ~3 μL dd H₂O auf die Oberfläche und lassen Sie es mindestens 5 Minuten einwirken, um unspezifisch gebundenes APS zu entfernen.
2. Setzen Sie die Sonde in den HS-AFM-Halter ein und positionieren Sie den Halter mit der Spitze nach oben auf dem AFM-Tisch. Spülen Sie den Halter mit ~100 μl dd H₂O, gefolgt von zwei ~100 μl Spülungen mit 0,22 μm gefiltertem Nukleosomen-Imaging-Puffer, der 10 mM HEPES, pH 7,5 und 4 mM MgCl₂ enthält.
3. Füllen Sie nach den Spülungen die Kammer mit ~100 μl Nukleosomen-Imaging-Puffer und tauchen Sie die Spitze ein. Passen Sie die Auslegerposition an, bis er vom Laser getroffen wird. Spülen Sie den APS-Glimmer mit 20 μl gefiltertem Nukleosomen-Imaging-Puffer mit ~4 μl pro Spülung.
4. 1 μl des Nukleosomen-Assemblierungsmaterials in 250 μl gefilterten Nukleosomen-Imaging-Puffer verdünnen, um eine endgültige Nukleosomenkonzentration von 1 nM zu erreichen. 2,5 μl dieser Verdünnung auf die Oberfläche auftragen und 2 min ziehen lassen. Spülen Sie die Oberfläche zweimal mit ~ 4 μl Nukleosomen-Imaging-Puffer ab. Lassen Sie die Oberfläche nach dem letzten Spülen mit dem Imaging-Puffer bedeckt.
   Anmerkung: Wenn die Oberfläche nach dem Ablegen der Nukleosomenprobe nicht gespült wird, wird die Oberfläche schnell überfüllt.
5. Setzen Sie den Scanner und die Probe so auf den Spitzenhalter, dass die Probe mit der Vorderseite nach unten zeigt. Um den Anflug zu starten, verwenden Sie die Auto-Annäherungsfunktion mit einer Sollwertamplitude von A_s nahe der freien Schwingungsamplitude A₀.
   Anmerkung: Im Idealfall ist A_s = 0,95 A₀, aber der Betrieb mit 82 % von A₀ funktioniert auch, wenn man vorsichtig ist.
6. Passen Sie den Sollwert an, bis die Oberfläche gut nachgeführt wird.
   Anmerkung: Um die Energieübertragung von der AFM-Spitze auf die Nukleosomenprobe zu minimieren, sollte die Amplitude des Cantilevers klein gehalten werden, mit Amplituden von nur 1 nm optimal.
7. Stellen Sie den Bildbereich auf 150 x 150 nm bis 200 x 200 nm mit einer Datenerfassungsrate von ~300 ms pro Bildrahmen ein.
   Anmerkung: Diese Bildgröße ist in der Regel ausreichend, um die Dynamik mehrerer Nukleosomen gleichzeitig zu erfassen. Eine weniger bestückte Oberfläche kann Änderungen an diesen Parametern erfordern. Die vorgeschlagene Bildrate ist ausreichend, um unter anderem Nukleosomendynamiken wie Looping, Sliding und Unwrapping zu erfassen (siehe Abschnitt "Repräsentative Ergebnisse" weiter unten).

Tabelle 1: Reagenzien, die für den kontinuierlichen Aufbau von Salzgradienten-Nukleosomen benötigt werden. Jede der aufgeführten Komponenten wird in das Mikrofurchenröhrchen gegeben, das die gereinigte DNA enthält. Dies sollte in der Reihenfolge erfolgen, in der die Reagenzien in der Tabelle aufgeführt sind, wobei zuerst Wasser und NaCl hinzugefügt werden, gefolgt von dem H2A/H2B-Dimer und dem Histon-Tetramer, die zuletzt hinzugefügt werden. Wenn vorgefaltete Histon-Oktamere verwendet werden sollen, fügen Sie diese im gleichen Verhältnis wie für das obige Tetramer hinzu. *Notieren Sie sich den NaCl-Gehalt in jedem der Histonstöcke und passen Sie die 5 M NaCl entsprechend an, wobei der endgültige [NaCl] 2 M betragen sollte (siehe Materialtabelle).

Ergebnisse

Abbildung 1: Schematische Darstellung der Spritzenpumpe, die für die mikroskalige Nukleosomenassemblierung verwendet wird.Die Montagemischung wird so positioniert, dass sie mit dem Ende der Spritzennadel in Kontakt kommt. Wenn der Verdünnungspuffer von der Spritzenpumpe an das Assemblierungsgemisch abgegeben wird, wird die Konzentration von NaCl verringert, was die Nukleosomenassemblierung fördert. Diese Abbildung ist eine Adapti...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Plasmid pGEM3Z-601	Addgene, Cambridge, MA	Artikel-Nr.: 26656
PCR-Primer	IDT, Coralville, IA	Sonderanfertigung	(FP) 5'- CAGTGAATTGTAATACGACTC-3' (RP) 5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3'
DreamTaq-Polymerase	ThermoFischer Scientific, Waltham, MA	EP0701	Katalognummer für 200 Stück
PCR-Aufreinigungskit	Qiagen, Hilden, Deutschland	Artikel-Nr.: 28104	Katalognummer für 50 Stück
Tris-Basis	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	10708976001	Katalognummer für 250 g
Edta	ThermoFischer Scientific, Waltham, MA	15576028	Katalognummer für 500 g
(CENP-A/H4)2, rekombinant human	EpiCypher, Durham, NC	Tel.: 16-0010	Katalognummer für 50 ug
H2A/H2B, rekombinant human	EpiCypher, Durham, NC	Tel.: 15-0311	Katalognummer für 50 ug
H3 Octamer, rekombinanter Mensch	EpiCypher, Durham, NC	Tel.: 16-0001	Katalognummer für 50 ug
Slide-A-Lyzer MINI Dialysegeräte-Kit, 10K MWCO, 0,1 mL	ThermoFischer Scientific, Waltham, MA	Artikel-Nr.: 69574	Katalognummer für 10 Geräte
Natriumchlorid	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	Nr. S9888-500G	Katalognummer für 500 mg
Amicon Ultra-0,5 mL Zentrifugalfilter	Millipore-sigma, Burlington, MO	UFC501008	Katalognummer für 8 Geräte
hcl	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	Artikel-Nr.: 258148-25ML	Katalognummer für 25 mL
Tricin	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	T0377-25G	Katalognummer für 25 g
Sds	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	11667289001	Katalognummer für 1 kg
Ammoniumpersulfat (AmmPS)	Bio-Rad, Hercules, Kalifornien	Artikel-Nr.: 1610700	Katalognummer für 10 g
30% Acrylamid/Bis-Lösung, 37,5:1	Bio-Rad, Hercules, Kalifornien	1610158	Katalognummer für 500 mL
TEMED	Bio-Rad, Hercules, Kalifornien	Artikel-Nr.: 1610800	Katalognummer für 5 mL
4x Laemmli Protein-Probenpuffer für SDS-PAGE	Bio-Rad, Hercules, Kalifornien	1610747	Katalognummer für 10 mL
2-ME	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	M6250-10ML	Katalognummer für 10 mL
PageRuler Vorgefärbte Proteinleiter	ThermoFischer Scientific, Waltham, MA	Artikel-Nr.: 26616	Katalognummer für 500 μl
Bio-Safe™ Coomassie Beize	Bio-Rad, Hercules, Kalifornien	1610786	Katalognummer für 1 L
Vliesstoff-Tücher für Reinräume: TX604 TechniCloth	TexWipe, Kernersvile, NC	TX604
Muskovit Block Glimmer	AshevilleMica, Newport News, VA	Klasse-1
Aminopropylsilatran (APS)	Synthetisiert wie in 22 beschrieben
HEPES	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	H4034-25G	Katalognummer für 25 g
Tesafilm	Scotch-3M, St. Paul, MN
Aron Alpha Industrial Krazy Kleber	Toagosei Amerika, West Jefferson, OH	AA480	Katalognummer für 2 g Tube
MgCl2	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	M8266-100G	Katalognummer für 100 g
Millex-GP Filter, 0,22 μm	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	SLGP05010	Katalognummer für 10 Geräte
BL-AC10DS-A2 AFM-Sonde (für HS-AFM)	Olympus, Japan
Verbindung FG-3020C-20	FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japan
Mischung FS-1010S135-0.5	FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japan
Hochgeschwindigkeits-Zeitraffer-Rasterkraftmikroskopie	Toshio Ando, Nano-Life Science Institute, Kanazawa University, Kakuma-machi, Kanazawa, Japan