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Alle Eingriffe mit menschlichen Teilnehmern wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien für das Wohlergehen des Menschen durchgeführt und vom lokalen institutionellen Prüfungsausschuss überprüft
>1. Primäre Fixierung, Nachfixierung, Einbettung, Teilung und Kontrastierung
- Bereiten Sie 1,6 ml primäre Fixierlösung (2,5 % Glutaraldehyd in 0,1 M Natriumcacodylatpuffer (pH 7,3)) in einem 2 ml-Mikrozentrifugationsröhrchen vor. Lagern Sie es bei 5 °C für maximal 14 Tage.
- Isolieren Sie aus der Muskelbiopsie oder dem ganzen Muskel eine kleine Probe, die einen maximalen Durchmesser von 1 mm in eine beliebige Richtung hat und in Längsfaserrichtung etwas länger ist als querschnittlich (zur Orientierung).
- Legen Sie die Probe in das Röhrchen mit der kalten primären Fixierlösung. Bei 5 °C 24 h lagern.
- Waschen Sie die Probe viermal (15 Minuten zwischen jedem Waschgang) in 0,1 M Natriumcacodylatpuffer (pH 7,3). Entfernen Sie mit Hilfe von Transferpipetten den gebrauchten Puffer aus dem Röhrchen, lassen Sie die Probe unberührt, und fügen Sie anschließend den frischen Puffer hinzu.
Anmerkung: Nach der abschließenden Wäsche kann die Probe mehrere Monate in dem 0,1 M Natriumcacodylatpuffer bei 5 °C gelagert werden. Das Protokoll kann hier pausiert werden.
- Postfix mit 1 % Osmiumtetroxid (OsO 4) und 1,5 % Kaliumferrocyanid (K4Fe(CN)6) in 0,1 M Natriumcacodylatpuffer (pH 7,3) für 120 min bei 4 °C.
Anmerkung: Die Verwendung von 1,5 % Kaliumferrocyanid (K4Fe(CN)6) ist für einen optimalen Kontrast der Glykogenpartikel unerlässlich.
- Zweimal in doppelt destilliertem Wasser bei Raumtemperatur (RT) spülen.
- Dehydrieren Sie durch Eintauchen in eine abgestufte Reihe von Alkohol (Ethanol) bei RT mit den folgenden Konzentrationen: 70 % (10 min), 70 % (10 min), 95 % (10 min), 100 % (10 min) und 100 % (10 min).
Anmerkung: In jedem Schritt wird die Probe in Ethanol getaucht, das anschließend nur teilweise entfernt wird, um ein Austrocknen der Probe zu vermeiden. Schließlich wird das übrig gebliebene Ethanol entsorgt.
- Infiltrieren Sie mit abgestuften Gemischen aus Propylenoxid und epossidischem Harz bei RT unter Verwendung der folgenden Volumenverhältnisse (Propylenoxid/epossidisches Harz): 1/0 (10 min), 1/0 (10 min), 3/1 (45 min), 1/1 (45 min), 1/3 (45 min), 0/1 (über Nacht). Am nächsten Tag werden die Proben in 100% frisches epossidisches Harz in Formen eingebettet und bei 60 °C für 48 h polymerisiert.
- Schneiden Sie ultradünne (60-70 nm) Abschnitte aus längsorientierten Fasern und sammeln Sie sie wie folgt auf Einloch-Kupfergittern.
- Montieren Sie den Block einer Probe auf den Ultramikrotomhalter.
- Schneiden Sie den Block mit einer Rasierklinge auf der Oberfläche ab, um die Höhe des Gewebes zu erreichen.
- Montieren Sie ein Diamantmesser (ultra cut 45) vor der Probe und richten Sie die Probenoberfläche parallel zum Messer aus.
- Stellen Sie mit dem Diamantmesser einen halbdünnen (1 μm) Schnitt her, um die Ausrichtung der Probe zu überprüfen. Färben Sie den halbdünnen Schnitt mit Toluidinblau für die Betrachtung mit dem Lichtmikroskop
.
- Schneiden Sie den Block weiter ab, um den interessierenden Bereich zu verkleinern und so die richtigen ultradünnen Schnitte zu erhalten.
- Schneiden Sie ultradünne (60-70 nm) Abschnitte mit einem zweiten Diamantmesser (ultra cut 45).
- Sammeln Sie 1-2 Abschnitte auf Einloch-Kupfergittern mit einem Perfect Loop.
Anmerkung: Das Einloch-Kupfergitter hat ein einzelnes Loch in der Mitte mit Formvar-Stützmembran .
- Kontrastieren Sie die Schnitte mit Uranylacetat und Bleicitrat, indem Sie die obigen Gitter 20 Minuten lang in Uranylacetatlösung (0,5 % in doppelt destilliertem Wasser) und dann 15 Minuten lang in Bleicitratlösung (1 % in doppelt destilliertem Wasser) tauchen. Waschen Sie die Gitter zwischen und nach den beiden Flecken in doppelt destilliertem Wasser.
Anmerkung: Das Protokoll kann hier pausiert werden.
>2. Bildgebung
- Schalten Sie das Transmissionselektronenmikroskop (betrieben mit einer Beschleunigungsspannung von 80 kV), den Computer und die Bildaufzeichnungssoftware ein. Nehmen Sie digitale Bilder mit einer digitalen 2 x 2 k CCD-Kamera mit langsamer Abtastung und der zugehörigen Bildgebungssoftware auf.
- Setzen Sie das Gitter mit mehreren Schnitten in den Mikroskoptisch ein.
- Rastern Sie das Raster zunächst bei geringer Vergrößerung (z. B. x100), um die Qualität der Schnitte (d. h. Löcher in der Stützmembran, Schmutz usw.) zu bestimmen und die Schnitte mit der besten Qualität auszuwählen. Bestimmen Sie bei geringer Vergrößerung die Richtung der Muskelfasern.
- Erhöhen Sie als Nächstes die Vergrößerung, indem Sie den Strahl auf eine periphere Faser in dem Abschnitt zentrieren. Fokussieren Sie das Bild bei einer Vergrößerung über 30 k, um ausreichend feine Details im Bild zu gewährleisten, unterstützt durch eine schnelle Fourier-Transformation in Echtzeit, falls verfügbar. Nehmen Sie abschließend Bilder mit 1 s Belichtungszeit bei der gewünschten Vergrößerung auf.
- Erfassen Sie insgesamt 24 Bilder einer zufällig ausgewählten Faser, d. h. 12 Bilder des myofibrillären Raums und 12 Bilder des subsarkolemmalen Raums, bei einer Vergrößerung zwischen 10 k und 40 k. Stellen Sie sicher, dass die Bilder über die Länge und Breite der Faser in einer zufälligen, aber systematischen Reihenfolge verteilt sind, um unverzerrte Ergebnisse zu erhalten (Abbildung 1A).
Anmerkung: Die optimale Vergrößerung hängt von der verfügbaren Kameraauflösung und der Größe der Schliffbilder ab. Ziel ist es, eine endgültige Auflösung zu erreichen, bei der Glykogenpartikeldurchmesser in Schritten von 1 nm gemessen werden können, und eine Gesamtfläche des myofibrillären Bereichs von mindestens 70 μm2 und eine Gesamtlänge der Faser von mindestens 25 μm zu umfassen, verteilt auf 12 Bilder des myofibrillären Raums und 12 Bilder des subsarkolemmalen Raums pro Faser, beziehungsweise. Die 24 Bilder pro Faser ergeben höchstwahrscheinlich eine Genauigkeit (Fehlerkoeffizient) des volumetrischen Gehalts der verschiedenen Glykogenpools zwischen 0,1 und 0,2 in einzelnen Fasern aus der Skelettmuskulatur von Menschen, Ratten und Mäusen (Abbildung 2E).
- Wiederholen Sie die Schritte 2.4 und 2.5, bis insgesamt 6-10 Fasern abgebildet sind. Schneiden Sie bei Bedarf weitere Abschnitte (mindestens 150 μm voneinander entfernt, um eine Überlappung der bereits abgebildeten Fasern zu vermeiden) und wiederholen Sie die Schritte 1.9-2.5.
>3. Bildanalysen
- Importieren Sie Bilder in ImageJ, indem Sie auf Datei > Öffnen klicken.
- Stellen Sie den globalen Maßstab so ein, dass er der Originalgröße des Bildes entspricht, indem Sie auf Analysieren > Maßstab festlegen klicken.
- Vergrößern Sie die Kamera um 100%, indem Sie auf Bild > Vergrößern > hineinzoomen.
- Messen Sie die Dicke einer Z-Scheibe pro Bild des myofibrillären Raums (12 pro Faser) mit dem Werkzeug "Gerade Linie" im Menü "Werkzeuge" (Abbildung 1D). Berechnen Sie die durchschnittliche Z-Scheibendicke jeder der 6-10 Fasern.
- Definieren Sie 2-3 Fasern mit der dicksten durchschnittlichen Z-Scheibe als Typ-1-Fasern und 2-3 Fasern mit der dünnsten durchschnittlichen Z-Scheibe als Typ-2-Fasern. Lassen Sie die dazwischen liegenden 2-4 Fasern für weitere Analysen außer Acht (Abbildung 1E).
HINWEIS: Die folgenden Schritte werden für jede der 4-6 Fasern aus der Probe wiederholt. Die Glykogenvolumenfraktionen werden durch Punktzählung geschätzt. Die Größe der Raster wird so gewählt, dass eine zufriedenstellend hohe Genauigkeit der Schätzungen erreicht wird. Dies wird oft durch das Erreichen von 250 Treffern erreicht, was dann die Gesamtzahl der benötigten Punkte und damit die Fläche pro Punkt bestimmt.
- Verwenden Sie das Werkzeug Segmentierte Linie, um die Länge der äußersten Myofibrille zu messen, die direkt unter der subsarkolemmalen Region sichtbar ist (Abbildung 2A).
Anmerkung: Diese Länge wird verwendet, um das subsarkolemmmale Glykogen pro Oberfläche zu exprimieren (d. h. die Länge des äußersten Myofibrillen multipliziert mit der Dicke des Schnitts (60 nm); siehe Schritt 4.5). Daher wird nur die subsarkolemmale Region, die durch diese Länge repräsentiert wird, in die Analyse einbezogen.
- Fügen Sie ein Raster ein, indem Sie auf Analysieren > Werkzeuge > Raster klicken und die Fläche pro Punkt auf 32.400 nm2 einstellen. Zählen Sie die Anzahl der Treffer innerhalb der verfügbaren Länge in den 12 subsarkolemmalen Bildern, bei denen ein Kreuz auf das subsarkolemmmale Glykogen trifft (Abbildung 2A). Ein Treffer ist definiert als ein Glykogenpartikel, das sich in der oberen rechten Ecke eines Kreuzes befindet.
- Fügen Sie ein Raster ein, indem Sie auf > Tools analysieren > Raster klicken und die Fläche pro Punkt auf 160.000 nm2 einstellen. Zählen Sie die Anzahl der Treffer in den 12 myofibrillären Bildern, bei denen ein Kreuz auf den intramyofibrillären Raum trifft (Abbildung 2B).
- Fügen Sie ein Gitter ein, indem Sie auf Analysieren > Werkzeuge > Gitter klicken und die Fläche pro Punkt auf 3.600 nm2 einstellen. Zählen Sie die Anzahl der Treffer in den 12 myofibrillären Bildern, bei denen ein Kreuz auf das intramyofibrilläre Glykogen trifft (Abbildung 2C).
- Fügen Sie ein Gitter ein, indem Sie auf Analysieren > Werkzeuge > Gitter klicken und die Fläche pro Punkt auf 32.400 nm2 einstellen. Zählen Sie die Anzahl der Treffer in den 12 myofibrillären Bildern, bei denen ein Kreuz auf das intermyofibrilläre Glykogen trifft (Abbildung 2D).
- Messen Sie mit dem Werkzeug "Geradlinige Linie" den Durchmesser von fünf zufällig ausgewählten Glykogenpartikeln jedes Pools für jedes der 12 Bilder, um einen Durchschnitt von 60 Partikeln pro Pool und Faser zu erhalten.
HINWEIS: Der Durchschnitt von 60 Partikeln deckt weitgehend die Variation innerhalb der Faser ab (Abbildung 2F).
