>1. Zelllinie und Zellkultur
- Züchten Sie RAW 264.7-Makrophagen in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), ergänzt mit 10 % (vol/vol) hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS), 100 IE/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2. Ersetzen Sie Wachstumsmedien jeden zweiten Tag.
- Wenn die Zellen zu 80 % zusammenfließen, waschen Sie die Platte zweimal mit sterilem PBS.
- Trennen Sie die Zellen durch Zugabe von 1.000 μl 0,5 % Trypsin-EDTA und inkubieren Sie die Zellkulturplatte für 3-5 min in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C.
- Untersuchen Sie die Platte unter einem Lichtmikroskop, um die Zelldissoziation zu bestätigen. Fügen Sie 10 ml Wachstumsmedium mit 10 % FBS hinzu, um Trypsin zu inaktivieren.
- Die Zellsuspension wird in einem konischen 50-ml-Röhrchen aufgefangen und 5 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 400 x g zentrifugiert. Resuspendieren Sie die Zellen schonend im vollständigen Zellkulturmedium und bestimmen Sie die Zellzahl und Lebensfähigkeit mit Trypanblau (0,4 %) Färbung.
Anmerkung: Die empfohlene minimale Zellviabilität für dieses Experiment beträgt >90 %.
Legen - Sie sterile Glasdeckgläser mit einer autoklavierten Pinzette in die Vertiefungen einer 24-Well-Platte. Säen Sie die Zellen mit einer Dichte von 1 x 106 Zellen/ml auf Deckgläser und inkubieren Sie die Platte über Nacht in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2.
- Wechseln Sie das Medium jeder Vertiefung vor der Behandlung durch frisches 500 μl Komplettmedium. Makrophagen mit Vehikel (DMSO oder andere Lösungsmittel zur Auflösung von EIPA) oder dem Makropinozytose-Inhibitor 5-(N-ethyl-N-isopropyl)-amilorid (EIPA, 25 μM) für 30 min vorbehandeln.
- Behandeln Sie Zellen mit Vehikeln und Stimulatoren der Makropinozytose, um die Membrankräusel zu fördern: Phorbol-12-Myristat-13-acetat (PMA, 1 μM, 30 min) und Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (M-CSF, 100 ng/ml, 30 min).
Anmerkung: Alternative Inhibitoren [z. B. Latrunculin A (1 μM, 30 min) oder Cytochalasin D (1 μM, 30 min)] und Stimulatoren [z. B. epidermaler Wachstumsfaktor (EGF, 100 ng/ml, 10 min) oder Thrombozyten-abgeleiteter Wachstumsfaktor (PDGF, 100 ng/ml, 15 min)] der Makropinozytose können ebenfalls zur Charakterisierung der Makropinozytose in Makrophagen und anderen Zelltypen verwendet werden. Die Zellen müssen möglicherweise über Nacht im Serum ausgehungert werden, bevor sie mit physiologischen Stimulatoren der Makropinozytose behandelt werden. Es ist wichtig zu beachten, dass die wirksamsten Konzentrationen und Inkubationszeiten bestimmt werden müssen, um die Makropinozytose in anderen Zelltypen zu stimulieren.
>2. REM-Fixierung
- Nach der Behandlung das Medium aus den Vertiefungen ansaugen und Deckgläser zweimal mit eiskaltem PBS waschen.
- Die Zellen (4 % Paraformaldehyd und 2 % Glutaraldehyd in 0,1 M Natriumcacodylat) werden 30 Minuten lang bei Raumtemperatur fixiert, gefolgt von einer Inkubation über Nacht im Fixiermittel bei 4 °C.
- Waschen und inkubieren Sie Deckgläser vorsichtig mit 500 μl der folgenden Reagenzien, ohne die Zellmonoschicht zu stören.
- Einmal in 0,1 M Natriumcacodylat waschen und 15 Minuten inkubieren.
- Zweimal mit dH2O waschen mit 10 min Inkubation in jeder Wäsche.
- Zweimal mit 25 % Ethanol waschen und bei jeder Wäsche 10 Minuten Inkubation haben.
- Zweimal mit 50 % Ethanol waschen und bei jeder Wäsche 10 Minuten Inkubation haben.
- Zweimal mit 75 % Ethanol waschen und bei jeder Wäsche 10 Minuten Inkubation haben.
- Zweimal mit 80% Ethanol waschen und dabei 10 Minuten Inkubation haben.
- Zweimal mit 95% Ethanol waschen und dabei jeweils 10 Minuten inkubieren.
- Zweimal mit 100% Ethanol waschen. Führen Sie eine 10-minütige Inkubation in jeder Wäsche durch.
Anmerkung: Das Wechseln/Ersetzen von Reagenzien sollte schnell erfolgen, um ein Austrocknen der Zellen durch die Luft zu verhindern. Deckgläser können mehrere Tage bei 4 °C in 100%igem Ethanol belassen werden. Für die Langzeitlagerung fügen Sie zusätzlich 100 % Ethanol hinzu und decken Sie die Vertiefungen mit Parafilm ab, um ein Austrocknen der Probe an der Luft zu verhindern.
>3. Trocknung des kritischen Punktes
- Legen Sie Deckgläser in einen Trockner für kritische Punkte und bedecken Sie sie mit 100% Ethanol. Drücken Sie die Ein-/Aus-Taste und öffnen Sie den CO2 -Tank.
- Drücken Sie die Kühltaste ca. 30 s lang, bis die Temperatur auf 0 °C sinkt. Drücken Sie die Fülltaste, bis eine Blase im Kammerfenster erscheint.
- Drücken Sie die Spültaste, bis der Geruch von Ethanol aus dem Spülauspuff verschwindet. Drücken Sie die Cool-Taste erneut, bis die Temperatur auf 0 °C sinkt.
- Drücken Sie erneut die Tasten Füllen und Spülen, um sie auszuschalten und den CO2 -Tank zu schließen. Drücken Sie erneut die Cool-Taste, um sie auszuschalten, und drücken Sie die Heat-Taste.
- Stellen Sie die Temperatur auf 42 °C und den Druck auf 1.200 psi ein. Sobald sich Druck und Temperatur stabilisiert haben, drücken Sie die Entlüftungstaste, damit der Druck langsam abnimmt.
- Sobald der Kammerdruck 150 psi erreicht, drücken Sie die Entlüftungstaste und warten Sie, bis der Druck auf 0 psi sinkt. Schalten Sie den Trockner für kritische Punkte aus und entfernen Sie die Deckgläser.
- Montieren Sie Deckgläser auf REM-Aluminium-Probenhalterungen mit Carbon-Klebelaschen und unterziehen Sie sie einer Sputterbeschichtung mit Gold/Palladium in einem Sputter-Coater.
- Schalten Sie den Netzschalter ein und warten Sie, bis das Vakuum 30 mTorr erreicht. Spülen Sie die Kammer, um Feuchtigkeit und Luft zu entfernen, indem Sie den Gasschalter ausschalten und das Feingasventil gegen den Uhrzeigersinn drehen.
- Sobald das Vakuum auf 200 mTorr ansteigt, schalten Sie den Gasschalter aus und warten Sie, bis das Vakuum 30 mTorr erreicht. Wiederholen Sie diesen Schritt 3 Mal.
- Drücken Sie die Timer-Taste und stellen Sie den Spannungsregler ein, bis das Messgerät 10 mA anzeigt. Entfernen Sie beschichtete Deckgläser aus der Kammer.
Anmerkung: Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers, um die Trocknung der Probe an kritischen Stellen und die Sputterbeschichtung durchzuführen.
>4. Bildgebung und Quantifizierung
- Setzen Sie Probendeckgläser in die Kammer eines Rasterelektronenmikroskops ein. Schließen Sie die Tür und drücken Sie die Evac-Taste.
- Öffnen Sie die SEM-Betriebssoftware. Stellen Sie die Beschleunigungsspannung auf 15 kv und den Arbeitsabstand auf 10 mm ein.
- Drücken Sie die Schaltfläche Koordinaten, und bewegen Sie sich um den Controller, bis die Zellen in der Mitte des Beobachtungsbildschirms angezeigt werden. Stellen Sie die Vergrößerung auf 3.500x ein und bilden Sie das Muster ab, indem Sie auf die Schaltfläche Foto klicken.
Anmerkung: Verwenden Sie eine höhere Vergrößerung (8.500x bis 16.000x), um die Plasmamembran detaillierter darzustellen.
