Intravitale Fluoreszenzmikroskopie zur Untersuchung der mikrovaskulären Thrombusbildung

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

>1. Anordnung der Tiere

1. Wiegen Sie eine Maus und füllen Sie das jeweilige Medikament (z.B. das Cannabinoid, 5 mg/kg Körpergewicht (KG)) in eine Insulinspritze. Verabreichen Sie das Medikament 30 Minuten vor der Thrombuseinleitung.
2. Indem Sie den Hals der Maus zwischen Daumen und Zeigefinger und den Schwanz der Maus mit dem kleinen Finger halten, strecken Sie das Tier und injizieren Sie das Medikament intraperitoneal (ip) in den unteren linken Quadranten des Bauches. Setzen Sie das Tier für 15 Minuten wieder in den Käfig
.
3. Bereiten Sie die Anästhesie mit Ketamin (90 mg/kg KG) und Xylazin (25 mg/kg KG) vor. 15 Minuten vor der Thrombusinduktion betäuben Sie die Maus. Setzen Sie die Maus in den Käfig, ziehen Sie leicht am Schwanz und injizieren Sie dem Betäubungsmittel ip eine Insulinspritze.
4. Setzen Sie die Maus bis zum Einsetzen der Narkose wieder in den Käfig. Um eine ausreichende Anästhesie zu überprüfen, kneifen Sie den Schwanz mit einer Zange zusammen.
5. Laden Sie 0,05 ml aufgetautes Fluorescein-Isothiocyanat-markiertes Dextran (FITC-Dextran; 5%, 150 kDa) in eine Insulinspritze. Achten Sie beim Befüllen der Spritze darauf, dass keine Luftblasen zurückbleiben, da selbst kleine intravenös (iv) verabreichte Luftblasen für das Tier tödlich sein können.
6. Platzieren Sie die betäubte Maus mit der Vorderseite nach unten auf einer Heizplatte. Stellen Sie die Heizplatte auf 37 °C ein.
7. Tragen Sie Augensalbe auf die Hornhaut der Maus auf. Desinfizieren Sie die Haut und verwenden Sie sterile Instrumente.
8. Nähen Sie zwei Nähte aus Polypropylen 7/0 in den kranialen und kaudalen Rand des rechten Ohrs. Platzieren Sie die Maschen so nah wie möglich am Rand und so nah wie möglich an der Basis (Abbildung 1B).
9. Bewegen Sie die Maus in die dorsale Position. Befestigen Sie alle Beine mit Klebestreifen an der Acrylglasplattform. Haken Sie eine Naht unter die Frontzähne ein und positionieren Sie den Kopf in Dorsalflexion, indem Sie die Naht mit Klebestreifen auf das Acrylglas kleben.
10. Verschieben Sie das Tier auf der Plattform unter dem Operationsstereomikroskop. Verwenden Sie eine 16-fache Vergrößerung.

>2. Präparation der linken Halsvene und Injektion von FITC-Dextran

Hinweis: Für die Mikroskopie des rechten Ohrs bereite die linke Halsvene vor.

1. Setzen Sie mit einem Skalpell einen 5 mm großen Schnitt in die Haut auf der linken Seite des Halses in kraniokaudaler Richtung. Präparieren Sie das Unterhautgewebe mit einer Mikrozange und einer Mikroschere. Entweder die sich kreuzenden Gefäße mit Polyester 8/0-Nähten oder mit Elektrokoagulation ligatisieren.
2. Befreien Sie die Vene mit einer Mikrozange und einer Mikroschere, ohne das Gefäß zu berühren, von ihrer Adventitia.
3. Verwenden Sie die vorbereitete Insulinspritze für die Injektion des Fluoreszenzfarbstoffs. Fassen Sie die Gefäßwand vorsichtig mit der Mikrozange an, ohne die Vene zu perforieren. Mit der Spritze in die aufgeblähte Gefäßwand eindringen und FITC-Dextran iv injizieren.
4. Stoppen Sie die Blutung nach dem Herausziehen der Spritze mit Wattestäbchen. Vermeiden Sie eine Kontamination des Ohrs mit Blut und Farbstoffen.

>3. Positionierung des rechten Ohrs für die Intravital-Fluoreszenzmikroskopie

1. Übertragen Sie das Tier auf der Heizplatte in eine Acrylglaskonstruktion mit einem Schlitz für die Heizplatte und einer 0,5 cm hohen Ebene zur Positionierung des Ohrs.
2. Fixieren Sie das Tier mit der Vorderseite nach unten mit Klebestreifen auf der Heizplatte. Platzieren Sie den relativ starken und konvexen Knorpel an der Basis des Ohres neben den 0,5 cm hohen Ebenen für das Ohr (Abbildung 1B), so dass der apikale Teil des Ohres flach auf der Ebene positioniert werden kann.
3. Geben Sie einen Tropfen 0,9 % NaCl bei Raumtemperatur auf die Acrylglasebene, um das Ohr zu positionieren. Platzieren Sie das rechte Ohr mit den vorgegebenen Nähten auf der konkaven Bauchseite nach unten auf dem Tropfen von 0,9 % NaCl. Nehmen Sie mit Wattestäbchen den Tropfen NaCl auf und lassen Sie die Ohrplane durch Kapillarkräfte am Acrylglas befestigen.
4. Kleben Sie die Nähte auf das Acrylglas, um die Position des Ohrs zu fixieren.
5. Geben Sie einen Tropfen 0,9 % NaCl bei Raumtemperatur auf die konvexe dorsale Seite des Ohrs. Legen Sie vorsichtig ein Deckglas (0,5 cm Durchmesser) auf das Ohr, ohne die in das Ohr eintretenden Basalgefäße zusammenzudrücken. Entfernen Sie mit Wattestäbchen so viel NaCl wie möglich unter dem Deckglas, um den Abstand zwischen dem Deckglas und den Zielgefäßen des Ohrs zu minimieren.

>4. Intravitale Fluoreszenzmikroskopie und Thrombusinduktion des rechten Ohrs

1. Justierung des Intravital-Fluoreszenzmikroskops für die FITC-Dextran-Visualisierung (450 - 490 nm; FT: 510; LP: 520). Verwenden Sie eine variable 100-W-Quecksilberlampe als Lichtquelle. Schließen Sie eine hochauflösende Schwarzweiß-CCD-Kamera an einen DVD-Recorder an.
2. Bringen Sie das Tier auf das Acrylglas, in dem sich die Heizplatte mit dem fixierten abduktierten Ohr befindet, auf den Schreibtisch des Intravital-Fluoreszenzmikroskops.
3. Suchen Sie mit 20-facher Vergrößerung (20-fache/0,95 numerische Apertur) und 20 % Lichtintensität nach einem venösen Gefäß mit einem Durchmesser von 50 - 60 μm und einem anterograden Blutfluss von 400 - 600 μm/s.
4. Geben Sie einen Tropfen Wasser mit Raumtemperatur auf das Deckglas, um das Objektiv mit 63-facher Vergrößerung (63-fache/0,95 numerische Blende) in Wasser einzutauchen. Verwenden Sie eine Spritze mit einer Kanüle mit einem Durchmesser von 1 mm und geben Sie den Tropfen auf das Objektiv des Mikroskops. Fügen Sie gerade so viel Wasser hinzu, dass das Deckglas und das Objektiv mit dem Wassertropfen in Kontakt kommen.
5. Beginnen Sie unmittelbar nach dem Auftragen des Wassertropfens mit der Aufnahme des Gefäßes für 20 s mit 20 % Lichtintensität für die Offline-Messung des Durchmessers und des Blutflusses.
6. Beginnen Sie mit der Thrombusinduktion 5 Minuten nach der Injektion von FITC-Dextran. Erhöhen Sie dazu die Lichtintensität auf 100%.
7. Schließen Sie während der Thrombusinduktion die Öffnung des Mikroskops für 2 s innerhalb eines Zeitraums von 30 s, um den Blutfluss zu überprüfen. Bei anhaltendem Blutfluss die Öffnung wieder öffnen. Bei gestopptem Blutfluss das Gefäß 30 s.
   beobachten Anmerkung: Das Gefäß wird als verschlossen eingestuft, wenn die Strömung 30 s oder länger stillsteht oder wenn das Blut retrograd fließt. Wenn der orthograde Blutfluss wieder einsetzt, öffnen Sie die Öffnung vollständig und setzen Sie die Thrombusinduktion fort, bis es wie oben beschrieben zu einem Gefäßverschluss kommt. Achten Sie bei der frühen Thrombusinduktion darauf, dass die Zeiten, in denen die Öffnung geschlossen wurde, um den Blutfluss zu überprüfen, so kurz wie möglich sind, um eine nahezu kontinuierliche Epi-Beleuchtung aufrechtzuerhalten. Später, während des Thrombuswachstums, wird das Gefäß mit einem weniger fluoreszierenden Farbstoff durchblutet, so dass es kontinuierlich beobachtet werden kann.
8. 5 Gefäße pro Ohr auswählen und verschließen. Begrenzen Sie die Zeit der Thrombusinduktion unter dem Mikroskop auf etwa 1 h nach der Injektion von FITC-Dextran.

Abbildung 1. Vorbereitung der Halsvene (A) und Platzierung des Ohres für die Intravitalmikroskopie (B). (A) Mit dem Operationsstereomikroskop wird die rechte Halsvene präpariert. Die Nähte für die Platzierung des linken Ohres werden vor der Injektion von FITC-Dextran genäht. Die Wunde aus der vorangegangenen Dissektion der linken Jugularvene wird mit transkutanen Nähten verschlossen (B). Das linke Ohr wird mit Fäden aus Polypropylen 7/0 fixiert. Ein Deckglas wird vorsichtig platziert, ohne die basalen Gefäße des Ohres zu komprimieren. Eine Heizplatte hält die Körpertemperatur des Tieres während des gesamten Versuchs aufrecht.