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Alle Eingriffe mit menschlichen Teilnehmern wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien für das Wohlergehen des Menschen durchgeführt und vom lokalen institutionellen Prüfungsausschuss überprüft.
>1. Vorbereitung der Cytospins
- Präparation von zwei Cytospins mit mononukleären Zellen der Patientenproben (d. h. ein Cytospin für die γH2AX-Immunfluoreszenzfärbung und ein Cytospin für die kombinierte Immunfluoreszenzfärbung von γH2AX und 53BP1) durch Zentrifugation (300 x g, 10 min) von 1,0 x 105 Zellen für jedes Präparat (Abbildung 1 und 2).
>2. γH2AX und 53BP1 Immunfluoreszenz-Färbung
- Fixierung und Permeabilisierung: Fixieren Sie die Zellen mit 200 μL 4% PFA für 10 min. Waschen Sie die Zellen nach der Fixierung dreimal vorsichtig mit 30 mL PBS für jeweils 5 min auf einem Laborschüttler. Dann permeabilisieren Sie die Zellen mit 200 μl 0,1% Octoxinol 9 für 10 min. Waschen Sie die Zellen dreimal vorsichtig mit 30 ml 5%iger Blockierungslösung für jeweils 5 Minuten auf einem Laborschüttler. Blockieren Sie die Zellen 1 h lang in 30 ml frischer 5%iger Blockierungslösung.
- Inkubation mit Antikörpern
- Eine Vorbereitung der Zellen wird über Nacht bei 4 °C mit einem monoklonalen Anti-γH2AX-Antikörper der Maus (1:500) und die andere Vorbereitung der Zellen mit einem monoklonalen Anti-γH2AX-Antikörper der Maus (1:500) und einem polyklonalen Kaninchen-Anti-53BP1-Antikörper (1:500) inkubiert.
- Nach der Inkubation waschen Sie die Zellen vorsichtig 3 Mal mit 30 ml 2%iger Blockierungslösung für jeweils 5 Minuten auf einem Laborschüttler.
- Entfernen Sie die Blockierungslösung und inkubieren Sie die erste Vorbereitung der Zellen mit einem Alexa488-konjugierten Ziegen-Anti-Maus-Sekundärantikörper (1:500) und die zweite Präparation der Zellen mit einem Alexa488-konjugierten Ziegen-Anti-Maus-Sekundärantikörper (1:500) und einem Alexa555-konjugierten Esel-Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper (1:500) für 1 h bei Raumtemperatur.
- Eindeckmedium: Legen Sie den Objektträger mit den Zellen in eine Schüssel und waschen Sie die Zellen vorsichtig dreimal vorsichtig mit 30 mL PBS für alle 5 min auf einem Laborschüttler. Entfernen Sie das PBS und mounten Sie die Zellen mit einem Einbettmedium, das 4,6-Diamidino-2-phenylindol enthält. Setzen Sie vorsichtig ein Deckglas auf das Eindeckmedium, damit keine Luftblasen eingebettet werden. Warten Sie mindestens 3 h auf die Aushärtung des Eindeckmediums, bevor Sie die Zellen mit dem Fluoreszenzmikroskop analysieren.
>3. Analyse von γH2AX- und 53BP1-Brennpunkten
- Fluoreszenzmikroskopie: Analysieren Sie die γH2AX- und 53BP1-Foki in den Zellkernen mit einem Fluoreszenzmikroskop, das mit Filtern für DAPI, Alexa 488 und Cy3 ausgestattet ist, während der Bildgebung bei einer 100-fachen Objektivvergrößerung. Nehmen Sie Bilder mit einer Kamera auf und bearbeiten Sie die Bilder mit entsprechender Bildgebungssoftware.
