Alle Eingriffe mit menschlichen Teilnehmern wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien für das Wohlergehen des Menschen durchgeführt und vom lokalen institutionellen Prüfungsausschuss überprüft.
1. Isolierung primärer humaner Monozyten durch immunomagnetische negative Selektion
- Sammeln Sie 40 ml frisches, menschliches Vollblut (entweder von einem HIV+-Patienten oder einer gesunden Kontrollgruppe) in vier 10-ml-Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)-Vakuumröhrchen (10 ml Blut pro Röhrchen). Übertragen Sie mit sterilen Techniken unter einer Biosicherheitswerkbank alle 40 ml Blut in ein konisches 50-ml-Propylenröhrchen.
- Gemäß dem Protokoll des Herstellers für das ausgewählte humane Monozyten-Isolationskit (Materialtabelle) geben Sie 2 ml Monozyten-Isolationscocktail, der im Kit enthalten ist, in das Blutröhrchen. Vortex-Magnetkügelchen, die ebenfalls im Kit enthalten sind, 30 s lang und geben Sie 2 ml in das Blutröhrchen.
- Wenn weniger als 40 ml Blut verfügbar sind, reduzieren Sie die hinzugefügten Reagenzien. Um die Lösung zu mischen, pipettieren Sie sie mit einer serologischen 25-ml-Kunststoffpipette auf und ab und inkubieren Sie sie 5 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT).
- Trennen Sie das Blutgemisch gleichmäßig in vier 50-ml-Röhrchen und geben Sie 30 ml sterile phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit 1 mM EDTA in jedes Röhrchen. Mischen Sie, indem Sie mit einer serologischen 25-ml-Kunststoffpipette auf und ab pipettieren.
- Legen Sie die Röhrchen für 10 Minuten in Magnethalter, um die antikörperkonjugierten Magnetkügelchen zu entfernen. Verwenden Sie vier Magnethalter gleichzeitig, einen für jedes Röhrchen, um konsistente Inkubations- und Isolationszeiten für jede Blutprobe zu ermöglichen.
- Ziehen Sie den Inhalt mit einer Pipette aus der Mitte jedes Röhrchens heraus, während er sich noch in den Magnethaltern befindet. Achten Sie darauf, keine roten Blutkörperchen zu entnehmen (nicht mehr als 10 % des Ausgangsvolumens von 10 ml) und geben Sie den Inhalt in eines von vier neuen 50-ml-Röhrchen.
- Geben Sie 500 μl wirbelnde magnetische Kügelchen in jedes 50-ml-Röhrchen. Pipettieren Sie mit einer 25-ml-Pipette auf und ab und inkubieren Sie 5 Minuten lang bei RT. Legen Sie dann die Röhren für 5 Minuten in Magnethalter.
- Übertragen Sie den Inhalt vorsichtig aus der Mitte jedes Röhrchens, während es sich noch in Magnethaltern befindet, in eines von vier neuen 50-ml-Röhrchen. Legen Sie jedes neue 50-ml-Röhrchen direkt für 5 Minuten in die Magnethalterungen.
- Übertragen Sie den Inhalt vorsichtig aus der Mitte jedes Röhrchens in eines von vier neuen 50-ml-Röhrchen. Schleudern Sie alle neuen 50 mL Röhrchen bei 300 x g für 5 min. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie alle vier Zellpellets in insgesamt 10 ml sterilem PBS.
- Zählen Sie Zellen durch Trypanblau-Ausschluss mit einem Hämozytometer.
HINWEIS: 8-20 x 106 Zellen werden im Allgemeinen aus 40 ml Vollblut gewonnen.