Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. PMC-Isolierung und -Kultivierung durch intraperitoneale Lavage
- PMC-Isolierung durch intraperitoneale Lavage
- Bereiten Sie vor der Zellisolierung die in Tabelle 1 aufgeführten Materialien vor.
- Verwenden Sie 8 bis 14 Wochen alte männliche Mäuse für die PMC-Isolierung. Euthanasieren Sie eine Maus durch Einatmen von CO2 und bestätigen Sie den Tod durch Verlust der Reflexe. Besprühen Sie die Maus mit 70% Ethanol und befestigen Sie sie mit Stecknadeln (mit der Rückenseite nach unten) auf einem Schaumstoffblock. Entfernen Sie die Bauchhaut der Maus mit einer stumpfen Schere. Vermeiden Sie eine Beschädigung der Bauchhöhle.
Anmerkung: Wir verwenden dieses Protokoll typischerweise für Mäuse mit einem genetischen Hintergrund des C57BL/6N-Stammes.
- Injizieren Sie 7 ml des eiskalten RPMI-Mediums und 5 ml Luft in die Bauchhöhle mit einer 10-ml-Spritze, die mit einer 27-G-Nadel ausgestattet ist. Schieben Sie die Nadel vorsichtig in das Bauchfell und perforieren Sie keine Organe. Verwenden Sie einen Fleck im Bereich des Nebenhodenfetts, um das Risiko einer Organperforation zu verringern.
- Schütteln Sie die Maus nach der Injektion 1 Minute lang, um die Peritonealzellen in das RPMI-Medium zu lösen. Schütteln Sie die Maus nicht zu stark, um eine Schädigung der inneren Organe und eine Verunreinigung der Bauchhöhle mit dem Blut zu vermeiden.
- Verwenden Sie die 10-ml-Spritze wieder, indem Sie sie mit einer neuen 20-G-Kanüle ausstatten. Verschieben Sie die inneren Organe auf eine Seite, indem Sie den Schaumstoffblock kippen und vorsichtig auf die Bank klopfen, um die Absaugung des Mediums von der anderen Seite aus zu erleichtern. Führen Sie eine 20-G-Nadel ein, schrägen Sie sie ab und saugen Sie die Flüssigkeit sanft und langsam (~0,5 mL/s) aus dem Bauch ab, um eine Verstopfung der inneren Organe zu vermeiden. Sammeln Sie so viel Flüssigkeit wie möglich (typischerweise 5–6 ml).
- Entfernen Sie die Nadel von der Spritze und geben Sie die gesammelte Zellsuspension in ein Sammelröhrchen auf Eis. Entsorgen Sie ein Probenröhrchen, wenn eine sichtbare Blutkontamination vorliegt.
- Zentrifugieren Sie die Röhrchen mit der Küvettensuspension bei ~300 x g für 5 min. Unter einer sterilen Haube wird der Überstand abgesaugt. Mischen Sie die Probenpellets für jede Maus in 4 mL kaltem (4–10 °C) PMC-Medium und geben Sie die Zellsuspension in einen 25 cm2 Kulturkolben. Fügen Sie die Wachstumsfaktoren IL-3 und SCF zu den Endkonzentrationen von 10 ng/ml bzw. 30 ng/ml hinzu. Den Kolben mit den Zellen in einen Inkubator (37 °C und 5 % CO2) stellen und ~48 h bis zum nächsten Eingriff inkubieren.
- PMC-Kultur
- Tag 2 (~48 h nach der Isolation): Mittlerer Wechsel
- Um die überstehenden und nicht anhaftenden Zellen (Erythrozyten und abgestorbene Zellen) zu entfernen, aspirieren Sie das Medium aus dem Kolben, indem Sie eine Pasteur-Pipettenspitze an den Rand des Kolbens setzen und den Kolben fast waagerecht halten. Geben Sie 4 ml vorgewärmtes PMC Medium pro Maus hinzu. Fügen Sie die Wachstumsfaktoren IL-3 (10 ng/ml) und SCF (30 ng/ml) hinzu. Den Kolben mit den Zellen in einen Inkubator (37 °C und 5 % CO2) stellen.
- Tag 9: Zellspaltung
- Übertragen Sie die Zellsuspension aus dem Zellkulturkolben in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen aus Kunststoff. Der Kolben wird dreimal mit 10 ml vorgewärmter (37 °C) Dulbecco-Kochsalzlösung (DPBS) gewaschen und die Zellsuspension mit den abgelösten Zellen in demselben 50-ml-Zentrifugenröhrchen aus Kunststoff aufgefangen. Zählen Sie die Zellkonzentration mit einem Hämozytometer und berechnen Sie die Gesamtzahl der Zellen.
- Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei ~300 x g für 5 min und aspirieren Sie den Überstand. Das Pellet wird in vorgewärmtem PMC-Medium (37 °C) zurückgewonnen, um die Zellkonzentration von 1 x 106 Zellen/ml zu erhalten. Die Zellsuspension wird in einen neuen 25 cm2 Kulturkolben überführt. Den alten Kolben mit den am Boden anhaftenden Fibroblasten entsorgen.
- Die Wachstumsfaktoren IL-3 (10 ng/ml) und SCF (30 ng/ml) werden zugegeben und der Kolben mit den Zellen in einen Inkubator (37 °C und 5 % CO2) gestellt.
- Tag 12–15: Zellmessungen
- Wenn Experimente mit der Stimulation von FcɛRI-Rezeptoren geplant sind, behandeln Sie die Zellen über Nacht mit 300 ng/ml IgE-Anti-DNP in einem Standardkulturmedium.
>2. Messung der Beta-Hexosaminidase-Freisetzung in PMCs
- Bereiten Sie vor den Messungen die in Tabelle 2 aufgeführten Materialien vor.
HINWEIS: β-Hexosaminidase, die nach ihrer Stimulation von MCs freigesetzt wird, hydrolysiert p-Nitrophenyl-acetyl-D-glucosamin (pNAG) zu p-Nitrophenol und N-Acetyl-D-glucosamin. Die Menge an β-Hexosaminidase in der Probe ist proportional zur Menge an p-Nitrophenol, die gebildet wird. In einer Umgebung mit hohem pH-Wert liegt p-Nitrophenol als vollständig deprotoniertes p-Nitrophenolat vor und kann durch seine Lichtabsorption bei 405 nm nachgewiesen werden.
- Bereiten Sie die Tyrode-Lösung vor, die 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,4 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 5,6 mM Glukose und BSA 0,1 % enthält. Stellen Sie den pH-Wert mit 3 M NaOH auf 7,4 ein.
- Bereiten Sie die Lyselösung vor, indem Sie der Tyrode-Lösung ein Volumen von 1 % Triton X-100 hinzufügen.
- Bereiten Sie die Stopplösung aus 200 mM Glycin vor und stellen Sie den pH-Wert mit NaOH auf 10,7 ein.
- Bereiten Sie die pNAG-Lösung (4-Nitrophenyl-2-acetamido-2-desoxy-β-D-glucopyranosid) Lösung vor, indem Sie pNAG in 0,4 M Zitronensäure auf eine Endkonzentration von 4 mM auflösen.
- Berechnen Sie die Anzahl der Zellen, die für den Assay benötigt werden (führen Sie den Assay in doppelter Ausführung durch). Verwenden Sie 200.000 PMCs pro Well. Für jeden Genotyp werden 2 Wells als Negativkontrollen (Tyrode-Lösung ohne Sekretagogen wie DNP oder Verbindung 48/80) und 2 Wells als Positivkontrollen (Tyrode-Lösung mit 10 μM Ionomycin) verwendet.
- Übertragen Sie die Zellen in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen aus Kunststoff, stellen Sie das Volumen mit der Tyrode-Lösung auf 15 mL ein und zentrifugieren Sie sie 4 Minuten lang bei 200 x g. Entfernen Sie den Überstand mit einer Pasteur-Pipette und resuspendieren Sie die Zellen in der Tyrode-Lösung auf 2 x 106 Zellen/ml.
- Übertragen Sie 100 μl der Zellsuspension pro Well auf eine 96-Well-Well-Platte mit V-Boden. Geben Sie 25 μl Stimulations- oder Kontrolllösung in jede Vertiefung (gemäß dem in Abbildung 1A dargestellten Pipettierschema). Inkubieren Sie die Zellen 45 Minuten lang bei 37 °C und 5 % CO2.
- Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie die 96-Well-Platte 5 Minuten lang auf Eis legen. Dann zentrifugieren Sie die Platte bei 4 °C für 4 min bei 120 x g. 120 μl des Überstands werden mit einer Mehrkanalpipette auf eine 96-Well-Platte mit flachem Boden übertragen und auf Eis gelegt. Vermeiden Sie es, die Zellpellets zu berühren, sondern saugen Sie den Überstand vollständig an.
- Geben Sie 125 μl Lysepuffer zu den Zellpellets. Inkubieren Sie die Zellpellets 5 Minuten lang bei Raumtemperatur und resuspendieren Sie sie nach der Inkubation durch wiederholtes Pipettieren (ca. 5 Mal).
- Pipettieren Sie 25 μl der pNAG-Lösung (4 mM) in die erforderlichen Vertiefungen einer neuen 96-Well-Platte mit flachem Boden. Geben Sie 25 μl von jedem Überstand in die vorbereitete pNAG-Lösung sowie 25 μl jedes Zelllysats.
- Die Reaktionschargen werden 1 h lang bei 37 °C inkubiert. Nach der Inkubation pipettieren Sie 150 μl Stopplösung in jede Vertiefung, um die Reaktion zu stoppen.
- Analysieren Sie die Platte mit einem Mikroplatten-Reader unter Verwendung einer Dual-Wellenlängen-Einstellung bei 405 nm mit einer Referenz von 630 nm für eine automatische Hintergrundsubtraktion. Aktivieren Sie im Erfassungsprogramm das Kontrollkästchen "Referenz" und wählen Sie im Menü des Programmelements "Absorption" "630 nm" aus der Dropdown-Liste aus. Wenn die optische Dichte der Proben zu hoch ist, bereiten Sie vor der erneuten Messung eine geeignete Verdünnung der Sonde vor.
Tabelle 1: Materialien für Schritt 1.
| 1 | Eis |
| arabische Ziffer | 10 mL Spritzen |
| 3 | 27 G Nadeln |
| 4 | 20 G Nadeln |
| 5 | Styroporblock und Stifte |
| 6 | Entnahmeröhrchen (50 mL Zentrifugenröhrchen aus Kunststoff) |
| 7 | 70% Ethanol |
| 8 | RPMI Medium (vorgekühlt und auf Eis aufbewahrt) |
| 9 | PMC Medium: RPMI Medium + 20% FCS (Fötales Kälberserum) + 1% Penicillin Streptomycin Lösung (Pen-Streptomycin Lösung) |
| 10 | Dulbecco-phosphatgepufferte Kochsalzlösung - DPBS (ohne Ca2+ und Mg2+) |
| 11 | Kulturflaschen (25 cm) |
| 12 | Wachstumsfaktoren Stammlösungen (IL-3: 1 μg/μL; SCF: 2,5 μg/ml) |
| 13 | Serologische Pipetten (10 mL) |
| 14 | Pipettenspitzen steril (20–200 μL) |
| Nr. 15 | Hämozytometer |
| 16 | Tisch-Zentrifuge |
| 17 | Schere und Pinzette |
| 18 | CO2 -Kammer für Mäuse |
| 19 | Offene sterile Haube |
| 20 | Geschlossene sterile Haube |
| 21 | Zell-Inkubator (37 °C und 5 % CO2) |
| 22 | Transferpipetten (20–200 μL) |
Tabelle 2: Materialien für Schritt 2.
| 1 | PMC (12–15 Tage alt) 1 x 106 Zellen/ml |
| arabische Ziffer | Anti-DNP-Antikörper (IgE) Stammlösung |
| 3 | DNP-HSA Stammlösung |
| 4 | Compound 48/80 Stammlösung |
| 5 | Ionomycin |
| 6 | 96-Well-Platte, V-förmiger Boden |
| 7 | 96-Well-Platten, flacher Boden |
| 8 | Zentrifugenröhrchen aus Kunststoff (15 mL) |
| 9 | Serologische Pipetten |
| 10 | Zell-Inkubator (37 °C und 5 % CO2) |
| 11 | Tisch-Zentrifuge |
| 12 | Mikrotiterplatten-Reader für optische Dichtemessungen |
| 13 | Mehrkanalpipette (20–200 μL) |
| 14 | Hämozytometer |
