Isolierung und Kultivierung von Maus-Kupffer-Zellen

Zusammenfassung

Quelle: Bourgognon, M., et al. Kupffer-Zellisolierung für Nanopartikel-Toxizitätstests. J. Vis. Exp. (2015)

In diesem Video demonstrieren wir die Isolierung von Kupffer-Zellen oder Lebermakrophagen aus der Leber der Maus. Die Leber wird mit einer Aufschlusslösung durchblutet, gefolgt von einer Dichtegradiententrennung. Die isolierten adhärenten Kupffer-Zellen können für die weitere Analyse verwendet werden.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

>1. Perfusion und Zellentnahme (Abbildung 1)

1. Bereiten Sie alle in der Materialtabelle beschriebenen Reagenzien frisch vor.
2. Die EGTA-Lösung (Ethylenglykoltetraessigsäure)/HBSS-Lösung (Hank's Balanced Salt Solution) (50 ml pro Maus) und die Kollagenase-Lösung (100 ml pro Maus) 30 min lang bei 40 °C erwärmen.
3. Spülen Sie den flexiblen Schlauch der Pumpe zuerst mit 70 % Ethanol. Gießen Sie 40 ml EGTA/HBSS-Lösung in ein Zentrifugenröhrchen, das in das Wasserbad getaucht ist, und spülen Sie den flexiblen Schlauch der Pumpe mit vorgewärmter EGTA/HBSS-Lösung aus.
4. Führen Sie eine terminale Anästhesie mit einem Barbiturat durch, um zuverlässig Bewusstlosigkeit zu erzeugen, bevor Atemdepression und Tod auftreten. Injizieren Sie Phenobarbiton in einer Dosis von 1 mg/kg i.p. in eine weibliche oder männliche CD1-Maus (35-45 g). Bestätigen Sie die Anästhesie durch Einklemmen der Zehen.
5. Rasieren Sie die Bauchhaare und sterilisieren Sie die Bauchoberfläche mit einer 70%igen Ethanollösung.
6. Schneiden Sie durch die Bauchhöhle und legen Sie die Pfortader und die untere Hohlvene frei, indem Sie den Darm seitlich nach links vom Bauch bewegen.
7. Starten Sie die Pumpe mit einer Geschwindigkeit von 1-3 ml/min mit EGTA/HBSS-Lösung und kanülieren Sie die Pfortader mit einer 23 g Schmetterlingsnadel (Flügelschnitt). Klemmen Sie den mit der 23 G Nadel kanülierten Abschnitt der Pfortadera ein und drehen Sie dann die Serrefine-Pinzette an der Oberfläche des geöffneten Mausbauchs um. Die Leber sollte innerhalb der ersten 30 Sekunden der Perfusion der EGTA/HBSS-Lösung schnell blass werden.
8. Schneiden Sie schnell den unteren Teil der unteren Hohlvene ein, um einen Überdruck in der Leber zu vermeiden, und erhöhen Sie dann die Flussrate schrittweise auf 7 ml/min in der ersten Minute der Perfusion. Das Tier stirbt an Blutungen infolge einer Venenpunktion im Hohlvenenbereich.
9. Wenn weniger als 5 ml EGTA/HBSS-Lösung im Zentrifugenröhrchen verbleiben, füllen Sie es mit Kollagenase-Lösung (40-50 ml) auf. Erhöhen Sie die Durchflussrate schrittweise auf 10 ml/min über 30 Sekunden.
10. Lassen Sie die Leber anschwellen, indem Sie mit einer Pinzette in Abständen von 5-10 Sekunden Druck auf die untere Hohlvene ausüben. Dies kann periodisch (5-10 Mal während der Verdauung) erfolgen. Dieser Schritt verbessert die Dissoziation der Leberzellen und verkürzt die Perfusionszeit mit Kollagenase.
11. Wenn weniger als 10 ml Kollagenaselösung im Zentrifugenröhrchen verbleiben, gießen Sie 40-50 ml vorgewärmte Kollagenaselösung in das Zentrifugenröhrchen.
12. Nach 10-15 Minuten Perfusion und ca. 70-80 ml perfundierter Kollagenaselösung üben Sie mit einer Pinzette einen kleinen Druck auf die Oberfläche der Leber aus. Ein Abdruck des Drucks zeigt an, dass Leberzellen dissoziiert sind.
13. Entnehmen Sie die Leber in einem Stück aus der Bauchhöhle und legen Sie sie in ein Zentrifugenröhrchen mit 20-30 ml Kupffer Cells Isolation Medium. Halten Sie die Leberzellen maximal 3 Stunden lang auf Eis oder bei 4 °C, um eine Beeinträchtigung der Lebensfähigkeit der Leberzellen zu vermeiden.
14. Wiederholen Sie den Perfusionsvorgang bei Bedarf bei mehreren Tieren, während Sie die durchblutete Leber auf Eis halten. Sammeln Sie ein bis drei Lebern zur Reinigung und fahren Sie mit Stufe 3 fort.

>2. Vorbereitung des Dichtegradienten für die Zentrifugation (Abbildung 2)

1. Fahren Sie mit den folgenden Schritten (Abschnitte 2, 3 und 5) unter sterilen Bedingungen fort und halten Sie die Zellen auf Eis oder bei 4 °C. Bereiten Sie die SIP (Lösung von isotonisch beschichteten Kieselsäurepartikeln) vor, indem Sie 15,3 ml beschichtete Kieselsäurepartikellösung mit 1,7 ml 10 x PBS mischen.
2. Um 20 ml 25%ige SIP-Lösung herzustellen, mischen Sie 5 ml SIP mit 15 ml PBS. Um 20 ml 50%ige SIP-Lösung herzustellen, mischen Sie 10 ml SIP mit 10 ml PBS.
3. Füllen Sie ein Zentrifugenröhrchen mit 20 ml der 50%igen SIP-Lösung. Kippen Sie das Zentrifugenröhrchen in einem Winkel von fast 90° und geben Sie die 25%ige SIP-Lösung (20 ml) mit einer 25 ml-serologischen Pipette langsam an die Seitenwand des Röhrchens, ohne die Oberfläche der 50%igen SIP-Schicht zu berühren. Wenn Sie die 25%ige SIP-Lösung hinzufügen, verringern Sie den Winkel des Rohrs schrittweise. Halten Sie den Dichtegradienten bis zur Verwendung auf Eis.

>3. Aufreinigung von Kupffer-Zellen (Abbildung 3)

1. Geben Sie eine perfundierte Leber in eine Petrischale mit 15 ml Kupffer Zellisoliermedium. Die Glisson-Kapsel (Membran der Leber) mit einer Schere aufreißen und alle Leberzellen in das Kupffer-Zell-Isolationsmedium abgeben. Die Lösung wird durch ein 100-μm-Zellsieb filtriert, um sie in einem Zentrifugenröhrchen aufzufangen. Wiederholen Sie den Perfusionsvorgang an weiteren perfundierten Lebern und poolen Sie die Zellen im selben Zentrifugenröhrchen (15 ml von einer Maus und bis zu 45 ml von drei Mäusen).
2. Die Zellsuspension wird bei 50 x g für 2 min bei 4 °C zentrifugiert. Parenchymzellen (Hepatozyten) befinden sich im Pellet und nicht-parenchymale Zellen (einschließlich Kupffer-Zellen) im Überstand.
3. Den Überstand in einem sauberen Zentrifugenröhrchen auffangen und bei 50 x g für jeweils 2 min zentrifugieren. Wiederholen Sie diesen Schritt noch dreimal.
4. Zentrifugieren Sie 15 Minuten lang bei 1.350 x g, um nicht-parenchymale Zellen zu pelletieren. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 10 ml Kupffer Zellisolationsmedium.
5. Die nicht-parenchymale Zelllösung wird auf dem diskontinuierlichen isotonischen Gradienten 25/50 % wie in 2.3 beschrieben zugegeben. Zentrifugieren Sie bei 850 x g für 15 min ohne Beschleunigung oder Pause.
6. Lokalisieren Sie die angereicherte Kupffer-Zellfraktion, die innerhalb der 25 %-SIP-Fraktion in der Nähe der 25/50 %-SIP-Schnittstelle trüb erscheint (Abbildung 3). Mit einer serologischen 10-ml-Pipette werden etwa 12 ml der angereicherten Kupffer-Zellfraktion aspiriert. Übertragen Sie die Zellen in ein Zentrifugenröhrchen mit 35-40 ml Kupffer Zellisolationsmedium. Vorsichtig mischen und bei 1.350 x g für 15 min bei 4 °C zentrifugieren, um die Zellen zu pelletieren.
7. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 5-10 ml vorgewärmtem Kupffer Zellkulturmedium. Zählen Sie die Zellen (Hämozytometer) und messen Sie die Lebensfähigkeit mit Hilfe der Trypanblau-Färbung.
8. Die gereinigten nicht-parenchymalen Zellen werden in 24-Well-Platten mit einer Dichte von 5 x 10⁵ Zellen/Well plattiert. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C und 5 % CO₂ (Abbildung 3). Entfernen Sie nach 30 Minuten vorsichtig das Medium, waschen Sie es einmal mit vorgewärmter Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) und ersetzen Sie es dann durch 500 μl frisches und vorgewärmtes Kupffer Zellkulturmedium (pro Well).

Ergebnisse

Abbildung 1: Leberperfusion. Nach der Narkose der Maus wird der Verdauungstrakt seitlich nach links vom Bauch verschoben, um die Pfortader (PV) zugänglich zu machen. Die PV wird mit einer langsamen Flussrate (1-3 ml/min) EGTA/HBSS-Lösung kanüliert und die untere Hohlvene (IVC) sofort rupturiert, um einen Überdruck in der Leber zu vermeiden. Innerhalb der ersten Minute der Perfusion wird die Flussr...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Euthatal (Pentobarbital-Natrium)	Merial
CD1-Mäuse	Der Charles-Fluss	-	Das Gewicht der Maus sollte zwischen 35 und 45 g variieren. Wir empfehlen die Verwendung von männlichen CD1-Mäusen, da ihr Gewicht schnell zunimmt (z. B. eine männliche CD1-Maus im Alter von 7 Wochen wiegt mehr als 35 g). Es ist auch ratsam, sich im Voraus mit dem Tierlieferanten in Verbindung zu setzen, um die Lieferung älterer Tiere zu arrangieren. Alternativ können auch Tiere im Haus sein, um das gewünschte Gewicht zu erreichen.
HBSS (Ca2+ und Mg2+ frei, mit Bikarbonat)	Lebenstechnologien	Artikel-Nr.: 14175-053	HBSS muss Ca2+ frei sein.
Ethylenglykoltetraessigsäure (EGTA)-Tetranatriumsalz	Sigma-Aldrich	Nr. E8145	EDTA kann auch verwendet werden, aber EGTA hat den Vorteil, dass es Ca2+ selektiv chelatisiert.
HEPES (1M)	Lebenstechnologien	Artikel-Nr.: 15630-056	ca. 100 ml
Kollagenase Typ-IV	Worthington	CSL-4	Es wird empfohlen, verschiedene Chargen von Kollagenase zu testen oder zumindest dem Lieferanten gegenüber zu erwähnen, dass das Produkt für die Isolierung von Leberzellen geeignet sein muss
Niedriger Glukose-DMEM	Sigma-Aldrich	Nr. D5523	500 ml
RPMI (mit Natriumpyruvat und Glutamax®)	Lebenstechnologien	Artikel-Nr.: 12633-012	500 ml
Penicillin/Steptomycin	Lebenstechnologien	Nr. 15140-122	ca. 100 ml
Fötales Rinderserum	Erster Link	Tel.: 60-00-850	500 ml
Trypanblau-Lösung	Sigma-Aldrich	Nr. T8154	ca. 100 ml
Beschichtete Kieselsäurepartikellösung (Percoll®)	GE Healtcare	Artikel-Nr.: 17-0891-02	Percoll® ist sehr stabil und kann mehrere Jahre gelagert werden
1x Phosphatgepufferte Kochsalzlösung	Lebenstechnologien	Nr. 10010-023	500 ml
10x phosphatgepufferte Kochsalzlösung	Lebenstechnologien	Tel.: 70011-036	500 ml
Schmetterlingsblutentnahme-Set (23G/305mm langer Schlauch)	Bd	367288
Spritzenvorsatzfilter (0,22 μm blauer Rand)	Minisart	16534-K
Zentrifugenröhrchen (50 ml Blue Cap)	BD Biosciences, Falke	35 2070
Petrischale (90 x 15 mm)	Thermo Fisher Scientific	BSN 101VR20
100 μm Zellsieb	Bd	Artikel-Nr.: 352360
Peristaltische Pumpe	Watson Marlow	SciQ 300	Spülen Sie die Schläuche vor und nach jedem Gebrauch mit sterilem PBS und 70 % Ethanol.
24-Well-Platten	Corning	Artikel-Nr.: 3526
Zentrifuge	Eppendorf	5810R
Zange mit Serraffination	Hammacher GmbH	Art. Nr. HSE 004-35 / Kat. Nr. 221-0051	Die Serrefine-Pinzette ermöglicht es, das mit der 23G-Nadel kanülierte Gefäß zu klemmen, ohne dass die Pinzette während des Perfusionsvorgangs festgehalten werden muss. URL: (http://www.hammacher.de/Laboratory-Products/Clamps-forceps/Serrefines/HSE-004-35-Serrefine::25126.html)
Abstreifer für Zellen	BD Biosciences, Falke	353086	Schneiden Sie die Enden der Klinge mit einer Schere, um Zellen in 24-Well-Platten zu kratzen.
EGTA (Ethylenglykoltetraessigsäure)/HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) Lösung			HBSS mit 0,5 mM EGTA und 25 mM HEPES. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 ein. Bereiten Sie 50 ml für jede Leber vor, um zu perfundieren.
Kollagenase-Lösung			DMEM mit niedrigem Glukosegehalt an Kollagenase Typ IV bei 100 IE/ml, 15 mM HEPES und 1% Penicllin/Streptamycin (v/v). Stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 ein. Bereiten Sie 100 ml für jede Leber vor, um zu perfundieren. Nach der Zugabe der Kollagenase wird empfohlen, die Lösung vor der Anwendung 30 Minuten lang aufzuwärmen. Dadurch kann die Kollagenaseaktivität optimal sein.
Kupffer Zell-Isolationsmedium			RPMI enthält 1% nicht-essentielle Aminosäuren (v/v), 1% Glutamax® (v/v) und 1% Penicllin/Streptomycin (v/v). Bereiten Sie mindestens 100 ml für 1-3 Lebern vor.
Kupffer Zellkulturmedium			RPMI enthält 10 % fötales Rinderserum, 1 % nicht-essentielle Aminosäuren (v/v), 1 % Glutamax® (v/v) und 1 % Penicllin/Streptamycin (v/v). Bereiten Sie mindestens 100 ml für 1-3 Lebern vor.
SIP (Lösung aus isotonisch beschichteten Kieselsäurepartikeln)			Mischen Sie 1,7 ml 10x phosphatgepufferte Kochsalzlösung mit 15,3 ml Percoll®, um 17 ml SIP zu erhalten.
25% SIP-Lösung			Mischen Sie 5 ml SIP mit 15 ml 1x Phosphat gepufferte Kochsalzlösung
50% SIP-Lösung			Mischen Sie 10 ml SIP mit 10 ml 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung
Lyse-Puffer			DMEM-Medien mit 0,9 % Triton X-100
PBS/BSA-Lösung			Bereiten Sie frische phosphatgepufferte Kochsalzlösung mit einem pH-Wert von 7,4 mit 1 % Rinderserumalbumin zu.