Differenzierung von human-induzierten pluripotenten Stammzellen in Makrophagen

Zusammenfassung

Quelle: Lopez-Yrigoyen, M., et al. Produktion und Charakterisierung menschlicher Makrophagen aus pluripotenten Stammzellen. J. Vis. Exp. (2020).

Dieses Video beschreibt eine in vitro Methode zur Erzeugung von Makrophagen aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs). Die Erzeugung von Makrophagen aus iPSCs erfolgt in drei Stufen: (i) Aggregation von iPSCs in Suspension zu dreidimensionalen Embryoidkörpern (EBs), die sich in mesodermale Zellen differenzieren, (ii) Bildung von Makrophagen-Vorläuferzellen aus den differenzierten EBs und (iii) Differenzierung der Makrophagen-Vorläuferzellen zu reifen, funktionsfähigen Makrophagen.

Protokoll

>1. Differenzierung von humanen iPSCs zu Makrophagen

HINWEIS: Eine schematische Zusammenfassung des Makrophagen-Differenzierungsprotokolls ist in Abbildung 1 dargestellt.

1. Aufbereitung von Zelldifferenzierungsfaktoren, Wachstumsfaktoren und anderen Reagenzien
   1. Herstellung von serumfreien Medien für humane embryonale Stammzellen (hESC-SFM; siehe Werkstofftabelle) durch Ergänzung von Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium-F12 (DMEM/F12) mit hESC-Supplement, 1,8 % w/v Rinderserumalbumin (BSA) und 0,1 mM 2-Mercaptoethanol.
   2. Bereiten Sie eine 0,1%ige Lösung von Schweinegelatine vor, indem Sie die Gelatine in sterilem Wasser auflösen. Gelatinelösung kann bis zu 2 Jahre bei 4 °C gelagert werden.
   3. Bereiten Sie Stammlösung für humanes morphogenetisches Knochenprotein (BMP4) (25 μg/ml) vor, indem BMP4 in eine 4 mM Chlorwasserstoff (HCl)-0,2 % BSA PBS-Lösung aufgelöst wird. Verteilen Sie die Stammlösung als 50 μl Aliquote in Kryoröhrchen. Stammlösungen können bis zu 1 Jahr bei -20 °C gelagert werden. Nach dem Auftauen kann das BMP4 5 Tage lang bei 4 °C gelagert werden.
   4. Bereiten Sie die humane VEGF-Stammlösung (100 μg/ml) des humanen vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors (VEGF) vor, indem VEGF in einer 0,2%igen BSA-PBS-Lösung aufgelöst wird. Verteilen Sie die Stammlösung in Form von 10 μl Aliquoten in Kryoröhrchen. Stammlösungen können bis zu 1 Jahr bei -20 °C gelagert werden. Nach dem Auftauen kann das VEGF-Material 7 Tage lang bei 4 °C gelagert werden.
   5. Bereiten Sie Stammzellfaktor-Stammlösung (SCF) (100 μg/ml) vor, indem Sie SCF in einer 0,2%igen BSA-PBS-Lösung auflösen. Verteilen Sie die Stammlösung in Form von 5 μl Aliquoten in Kryoröhrchen. Stammlösungen können bis zu 1 Jahr bei -20 °C gelagert werden. Nach dem Auftauen kann der SCF 10 Tage lang bei 4 °C gelagert werden.
   6. Bereiten Sie humane Interleukin-3 (IL3)-Stammlösung (10 μg/ml) vor, indem IL3 in eine 0,2%ige BSA-PBS-Lösung gelöst wird. Verteilen Sie die Stammlösung als 500 μl Aliquote in Kryoröhrchen. Stammlösungen können bis zu 2 Jahre bei -20 °C gelagert werden. Nach dem Auftauen kann der Lagerbestand IL3 15 Tage lang bei 4 °C gelagert werden.
   7. Bereiten Sie die Stammlösung für humane Makrophagen mit koloniestimulierendem Faktor (CSF1) (10 μg/ml) vor, indem Sie CSF1 in eine 0,2%ige BSA-PBS-Lösung auflösen. Verteilen Sie die Stammlösung als 1 mL Aliquote in Kryoröhrchen. Stammlösungen können bis zu 2 Jahre bei -20 °C gelagert werden. Nach dem Auftauen kann der Vorrat CSF1 15 Tage lang bei 4 °C gelagert werden.
2. Stufe 1: Erzeugung von Embryoidkörpern (Tag 0–Tag 3)
   1. An Tag 0 werden 2,25 ml Medium der Stufe 1 (hESC-SFM, ergänzt mit 50 ng/mL BMP4, 50 ng/mL VEGF und 20 ng/mL SCF) in zwei Vertiefungen einer 6-Well-Platte mit ultraniedriger Bindung gegeben.
   2. Ersetzen Sie das Erhaltungsmedium eines zu 80 % konfluenten Wells von iPSCs in einer 6-Well-Platte durch 1,5 mL Medium der Stufe 1.
   3. Schneiden Sie die Kolonien mit dem Zellpassage-Werkzeug und übertragen Sie die geschnittenen Kolonien mit einer Pipette in die beiden Vertiefungen einer 6-Well-Platte mit ultraniedrigem Aufsatz (siehe Materialtabelle).
   4. An Tag 2 werden die Zytokine mit 0,5 ml hESC-SFM-Medien auf eine Endkonzentration von 50 ng/ml BMP4, 50 ng/ml VEGF und 20 ng/ml SCF gebracht.
      Anmerkung: IPSC-Kolonien werden zu EBs (Abbildung 2A).
3. Stadium 2: Entstehung hämatopoetischer Zellen in Suspension
   1. An Tag 4 4 Vertiefungen einer 6-Well-Gewebekulturplatte mit 0,1 % w/v Gelatine beschichten und mindestens 10 Minuten inkubieren.
   2. Entfernen Sie die Gelatine und fügen Sie 2,5 ml Medium der Stufe 2 hinzu (X-VIVO15 ergänzt mit 100 ng/ml CSF1, 25 ng/ml IL-3, 2 mM Glutamax, 1 % Penicillin-Streptomycin und 0,055 mM 2-Mercaptoethanol).
   3. Sammeln Sie geformte EBs in einem 50-ml-Zentrifugenröhrchen und lassen Sie sie durch die Schwerkraft am Boden des Röhrchens absetzen. Saugen Sie das Medium vorsichtig an.
   4. Resuspendieren Sie EBs in 2 mL eines Stufe-2-Mediums.
   5. Übertragen Sie 10–15 EBs (nicht mehr als 15) in eine mit Gelatine beschichtete Vertiefung mit 2,5 ml Medium der Stufe 2.
   6. EBs bei 37 °C und 5 % CO₂ Luft inkubieren.
   7. Wechseln Sie die Medien auf plattierten EBs alle 3–4 Tage für 2–3 Wochen.
   8. Nach 2–3 Wochen beginnen die EBs, nicht-adhärente hämatopoetische Zellen in Suspension freizusetzen.
      Anmerkung: Diese Zeit der Freisetzung von Suspensionszellen kann variieren und ist abhängig von der Zelllinie. Zellen in dieser Suspension können geerntet und zu Makrophagen gereift werden (siehe Stadium 3) (Abbildung 2A).
4. Stufe 3: Reifung der terminalen Makrophagen
   1. Sammeln Sie hämotopoetische Suspensionszellen und füllen Sie das Medium (Medium der Stufe 2) auf der EB-Platte auf.
   2. Suspensionszellen bei 200 x g für 3 min zentrifugieren.
   3. Resuspendieren Sie Suspensionszellen in Medien der Stufe 3 (X-VIVO15 ergänzt mit 100 ng/ml CSF1, 2 mM Glutamax und 1 % Penicillin-Streptomycin).
   4. Gesammelte und gesponnene Zellen auf unbehandelten 10 cm großen bakteriologischen Kunststoffplatten (10 ml) oder unbeschichteten 6-Well-Gewebekulturplatten (3 ml) mit einer Dichte von 0,2 x 10⁶ Zellen/ml.
   5. Bewahren Sie die Zellen 9–11 Tage lang in Medien der Stufe 3 auf und wechseln Sie das Medium alle 5 Tage.
      Anmerkung: Die Schritte 1.4.1–1.4.5 aus Stufe 3 können alle 3–4 Tage wiederholt werden, und Suspensionszellen können bis zu 3 Monate lang aus der ursprünglichen EB-Platte entnommen werden.

Ergebnisse

Abbildung 1: Grafische Zusammenfassung der iPSC-Differenzierung zu reifen funktionellen Makrophagen. Diagramm gezeichnet mit Biorender.

Abbildung 2: iPSC-Differenzierung zu Makrophagen und iPSC-DM-Anzahl und Morphologie. (A) Hell...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
CellMask Tiefroter Plasmamembran-Fleck	Thermofischer	Nr. C10046	Kryokonservierungsmedien
Kryostor CS10	Sigma	Nr. C2874
CTS CELLstart Substrat	Invitrogen	A1014201	Substrat für Stammzellen
Gelatine aus Schweinehaut	Sigma	Nr. G9136
Rekombinantes humanes BMP4-Protein	Forschung und Entwicklung	Artikel-Nr.: 314-BP-010
Rekombinantes humanes IL3	Preprotech	Tel.: 0200-03-10
Rekombinante humane MCSF (trägerfrei) 100ug	Biolegende	574806
Rekombinantes humanes VEGF-Protein	Forschung und Entwicklung	Artikel-Nr.: 293-VE-010
SCF (C-Kit Ligand) Rekombinantes humanes Protein	Thermofischer	PHC2111
StemPro hESC SFM	Thermofischer	A1000701
StemPro EZPassage Einweg-Stammzell-Pässeierwerkzeug	Thermofischer	23181010
Ultraniedrige Anhaftungsplatten: Zellkultur-Multiwell-Platte, 6 Well, zellabweisende Oberfläche für Sternzellen	Greiner	Artikel-Nr.: 657970
2-Mercaptoethanol (50 mM)	Invitrogen	31350010
DPBS, Kalzium, Magnesium (500ml)	Thermofischer	14040091
GlutaMAX Ergänzung	Thermofischer	35050061