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Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem JoVE Veterinärprüfungsausschuss überprüft.
Alle Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee an der University of California San Francisco genehmigt und in Übereinstimmung mit dem NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals durchgeführt.
>1. Sammeln Sie lumbale DRG von experimentellen Mäusen
- Bevor Sie mit dem Experiment beginnen, bereiten Sie die Arbeitslösung des Dichtegradientenmediums (z. B. Percoll) vor, indem Sie 9 Volumina des Mediums mit 1 Volumen Ca++/Mg++-freiem 10x HBSS mischen. Bewahren Sie es auf Eis auf.
- Betäuben Sie die Maus mit 2,5% Avertin. Vergewissern Sie sich, dass das Tier durch die fehlende Reaktion auf das Kneifen der Hinterpfote vollständig betäubt ist.
HINWEIS: Es wurden sowohl männliche als auch weibliche Mäuse im Alter von 6-8 Wochen verwendet.
- Perfundieren Sie die Maus transkardial mit 10 mL vorgekühltem 1x PBS.
- Bringen Sie die Maus in Rückenlage mit vier Pfoten, die mit dem Klebeband in einem chemischen Abzug gesichert sind. Heben Sie die Haut mit der Pinzette unter den Brustkorb und machen Sie einen kleinen Schnitt mit einer chirurgischen Schere, um Leber und Zwerchfell freizulegen.
- Schneiden Sie weiterhin mit einer Schere das Zwerchfell und den Brustkorb ab und öffnen Sie die Pleurahöhle, um das schlagende Herz freizulegen.
- Schneiden Sie schnell das rechte Vorhofohr mit einer Irisschere ab. Sobald die Blutung festgestellt wird, führen Sie eine 30-G-Nadel in das hintere Ende des linken Ventrikels ein und injizieren Sie langsam 10 ml vorgekühltes 1x PBS, um das Tier zu perfundieren.
- Führen Sie eine dorsale Laminektomie an der Maus durch, die sich in Bauchlage befindet.
Anmerkung: Wenn eine Zellkultur geplant ist, besprühen Sie die Maus vor der Inzision mit 70% Ethanol und verwenden Sie vorsterilisierte chirurgische Instrumente zur Dissektion.
- Verwenden Sie ein Skalpell der Größe 11, um einen longitudinalen seitlichen tiefen Schnitt zu machen, der von der Brustregion bis hinunter zur Sakralregion reicht. Entfernen Sie die Haut mit der Schere, um die dorsale Muskelschicht freizulegen.
- Verwenden Sie Friedman-Pearson Rongeur, um das Bindegewebe und die Muskeln abzuziehen, bis die lumbosakralen Wirbelsäulenfortsätze und die bilateralen Querfortsätze freigelegt sind.
- Verwenden Sie eine Noyes-Federschere, um die dorsale Wirbelsäule vorsichtig zu öffnen, und wechseln Sie dann zu einer Friedman-Pearson Rongeur, um die Wirbelknochen zu entfernen und das Rückenmark mit intakten Spinalnerven freizulegen.
- Präparieren Sie vorsichtig ipsilaterales und kontralaterales lumbales DRG (L4/L5 DRG in unserer Studie) und geben Sie es in 1 mL eiskaltes Ca++/Mg++-freies 1x HBSS in einem Dounce Gewebehomogenisator. Nun sind die Taschentücher bereit für Schritt 2.
Anmerkung: Kürzen Sie nach Möglichkeit den Spinalnerv, der mit dem DRG verbunden ist.
>2. Isolierung einzelner Zellen aus Maus-Lendenwirbelsäulen-DRG
- Homogenisieren Sie das DRG-Gewebe mit einem losen Stößel im Dounce Homogenisator 20-25 Mal.
- Legen Sie ein steriles 70-μm-Zellsieb aus Nylon in ein steriles konisches 50-ml-Röhrchen. Befeuchten Sie das Zellsieb mit 800 μL eiskaltem 1x HBSS, und der Durchfluss wird im konischen Röhrchen aufgefangen.
- Sammeln Sie die homogenisierte Gewebesuspension mit einer Pipette aus dem Homogenisator und geben Sie sie durch das feuchte 70 μm Nylon-Zellsieb in das konische 50-ml-Röhrchen.
- Spülen Sie den Homogenisator zweimal mit 800 μL eiskaltem 1x HBSS und füllen Sie ihn dann mit einem Zellsieb in dasselbe konische 50 mL-Röhrchen um, um die Ausbeute zu erhöhen.
- 1,5 ml äquilibriertes eiskaltes isotonisches Dichtegradientenmedium (hergestellt in Schritt 1.1) in ein steriles 5-ml-FACS-Röhrchen aus Polystyrol geben.
- Das Zellhomogenat aus dem konischen 50-ml-Röhrchen (in Schritt 2.4) in das FACS-Röhrchen überführen und durch Auf- und Abpipettieren gut mit dem Dichtegradientenmedium mischen. Fügen Sie weitere 500 μl 1x HBSS hinzu, um die Oberseite zu versiegeln.
- Die Zellen werden durch Zentrifugation bei 800 x g für 20 min bei 4 °C pelletiert.
- Aspirieren Sie den myelinhaltigen Überstand vorsichtig im Medium, ohne das Zellpellet am Boden des FACS-Röhrchens zu stören.
- Resuspendieren Sie die Zellen in PBS oder FACS-Puffer mit 5 % fötalem Rinderserum (FBS) für die FACS-Analyse.
Anmerkung: Mindestens 50.000 bis 100.000 Zellen werden vom L4 /L5 DRG einer Maus erwartet.
- Die mechanisch isolierten DRG-Zellen (L4/L5) werden in 100 μl PBS mit 5 % fötalem Rinderserum resuspendiert und anschließend mit α-Maus-Antikörper CX3CR1-APC (1:2.000) im Dunkeln bei 4 °C für 1 h inkubiert.
- Waschen Sie die Zellen einmal mit 5 mL PBS und zentrifugieren Sie die Zellen 8 Minuten lang bei 4 °C in 360 x g.
- Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet dann in 300 μl PBS für die FCAS-Analyse. Wenn eine Zellsortierung geplant ist, suspendieren Sie die Zellen stattdessen im FACS-Puffer.