Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Schritte der chirurgischen Exzision und Gewebevorbereitung:
- Operative Entfernung des Dünndarms (SI)
- Euthanasieren Sie Mäuse durch CO2 -Erstickung oder eine gleichwertige Methode, die von der institutionellen Tierethikkommission genehmigt wurde.
- Bringen Sie die Maus für die chirurgische Entfernung in einen speziellen Bereich. Legen Sie den Rücken nach unten und desinfizieren Sie den Bauch mit 70% Ethanol. Führen Sie eine Laparotomie durch, indem Sie die Bauchhaut und das Bauchfell entlang der Mittellinie vom Schambein bis zum Brustkorb durchtrennen und so die Bauchhöhle öffnen.
Anmerkung: Führen Sie den ersten Schnitt an einer relativ kleinen Hautstelle durch, um ein Eindringen in die Bauchhöhle und eine Schädigung des Darmgewebes zu vermeiden. Setzen Sie die Exzision bis zur gewünschten anatomischen Grenze fort.
- Identifizieren Sie den Blinddarm, der ein idealer Orientierungspunkt für die Detektion des terminalen Ileums ist, das das distale Segment des Dünndarms darstellt.
Anmerkung: Der Blinddarm befindet sich in der Regel auf der unteren linken Seite des Bauches der Maus.
- Lokalisieren Sie den ileozäkalen Übergang und machen Sie einen Schnitt auf dieser Höhe so distal wie möglich, um den Dünndarm vom Blinddarm zu trennen. Vermeiden Sie in den nächsten Schritten übermäßigen Körperkontakt mit der Darmwand, da zerbrechliche PPs bei Berührung leicht zusammenbrechen.
- Entfernen Sie vorsichtig den gesamten Dünndarm bis zum Pylorusschließmuskel, indem Sie das Mesenterium mit einer Schere durchtrennen. Identifizieren Sie den Übergang zwischen dem Pylorus und dem Zwölffingerdarm und schneiden Sie den Zwölffingerdarm auf dieser Höhe ab, was zu einer vollständigen Ablösung des Dünndarms von der Bauchhöhle führt.
HINWEIS: (i) Vermeiden Sie eine Überstreckung, da dies zum Bruch der Darmwand führen kann. (ii) Wenn zusätzlich zu den PP-Lymphozyten eine Isolierung von LP-Lymphozyten gewünscht wird, ist eine vollständige Entfernung des Mesenterialfetts erforderlich. Bei der reinen PP-Isolierung könnte das verbleibende mesenteriale Fett jedoch während der weiteren Isolationsschritte einige Vorteile bieten; Daher sollte es aufbewahrt werden.
- Legen Sie den abgelösten Dünndarm in eine 6-Well-Platte, die mit kaltem RPMI + 10 % fötalem Rinderserum (FBS) gefüllt ist, und bewegen Sie das Gewebe vorsichtig manuell, bis alle Darmsegmente in das kalte Medium eingetaucht sind. Halten Sie das Taschentuch während der nächsten Schritte auf Eis.
- Nachdem Sie die gewünschte Anzahl von Maus-Dünndarmen präpariert haben, fahren Sie mit der PP-Exzision aus dem gesammelten Dünndarm fort.
- Chirurgische Exzision von PPs und Herstellung einer einzelligen Suspension:
- Übertragen Sie den Dünndarm vorsichtig auf ein Papiertuch, indem Sie das Mesenterialfett mit einer Zange greifen und die Mesenterialseite zum Papiertuch hin platzieren. Befeuchten Sie den gesamten Darmabschnitt mit kaltem RPMI + 10% FBS, um Austrocknung und Klebrigkeit des Gewebes zu vermeiden.
Anmerkung: Verbleibendes mesenteriales Fett kann in diesem Stadium hilfreich sein, da Fettgewebssegmente auf der mesenterialen Seite des SI an dem Papiertuch haften und die anti-mesenteriale Seite nach oben zeigen.
- Identifizieren Sie die PPs, die als weiße, mehrlappige Aggregate in einer "blumenkohlähnlichen" Form auf der anti-mesenterialen Seite der Darmwand erscheinen.
Anmerkung: Das Ausspülen des Luminalgehalts wird erst empfohlen, wenn alle PPs herausgeschnitten sind. Das Entleeren des Luminalgehalts kann zum Kollaps der PPs führen und verhindert den Farbkontrast zwischen PPs und der Darmwand, was für die visuelle Identifizierung von PPs sehr hilfreich ist.
- Nach der Identifizierung von PPs auf der antimesenterialen Seite wird die chirurgische Schere mit gebogenem Ende auf die PPs gelegt (die Kurve sollte nach oben zeigen) und die PP von ihrer distalen und proximalen Grenze zurückhalten.
wahlfrei: Schieben Sie das PP mit einer Fingerspitze vorsichtig in Richtung der Scherenklingen. Dieses Manöver führt zu einem besseren Ausschluss von umgebendem Nicht-PP-Gewebe. Die PP werden vorsichtig herausgeschnitten und das umgebende Darmgewebe ausgenommen.
HINWEIS: (i) Dieser Schritt ist entscheidend, um eine maximale PP-Zellausbeute zu erzielen und gleichzeitig die Zellkontamination durch benachbarte Darmkompartimente wie LP und Darmepithel, die ebenfalls reich an T-Zellen sind, zu minimieren. (ii) Von einem SI, das aus einer C57BL/6-Maus herausgeschnitten wurde, können 5-10 PP (durchschnittliche Größe, mehrlapuliert) entnommen werden. Durch das Streben nach noch kleineren PPs (nicht mehrlapuliert) ist die Entnahme von bis zu 12-13 PPs pro Maus (C57BL/6) mit diesem Protokoll möglich.
- Übertragen Sie die exzidierten PPs auf eine 12-Well-Gewebekulturplatte, die mit eiskaltem RPMI + 10 % FBS gefüllt und mit einer Pinzette oder einer gebogenen chirurgischen Schere auf Eis gehalten wird.
HINWEIS: (i) Unmittelbar nach der Entfernung von PP können Schleim und Darminhalt auf der PP-Oberfläche gereinigt werden, indem das Taschentuch vorsichtig auf einem Papiertuch verreibt wird. Dieser Schritt trägt dazu bei, die Lebensfähigkeit von PP-Lymphozyten zu verbessern. (ii) Anstatt die PP auf eine Platte zu übertragen, kann in Abhängigkeit von der Gesamtzahl der Proben auch eine Übertragung in getrennte Röhrchen in Betracht gezogen werden.
- Optional: Wenn die PP-Exzision und die anschließende Platzierung in die Well-Platte abgeschlossen sind, kann die Anzahl und Größe der PPs, die aus verschiedenen Versuchs-/Mausgruppen entnommen wurden, dokumentiert werden, indem ein Foto der Gewebekulturplatte mit PPs gemacht wird.
- Bereiten Sie einen Satz konischer 50-ml-Röhrchen vor, gefüllt mit 25 mL RPMI + 10 % FBS (vorgewärmt auf 37 °C). Schneiden Sie mit einer Schere die Kante einer 1.000-μl-Spitze aus der Entfernung ab, die das Absaugen der PPs mit einer 1-ml-Pipette ermöglicht. Aspirieren Sie die PPs mit einer 1-ml-Pipette und übertragen Sie sie von der 12-Well-Gewebekulturplatte in die vorbereiteten konischen 50-ml-Röhrchen.
Anmerkung: Verwenden Sie für jede Mausprobe eine neue Spitze, um Kreuzkontaminationen zwischen den Proben zu vermeiden.
- Sichern Sie den Deckel und legen Sie die Röhrchen senkrecht in einen Orbitalschüttler bei 37 °C und unter kontinuierlichem Rühren bei 125–150 U/min für 10 Minuten. Bereiten Sie in der Zwischenzeit einen neuen Satz 50-ml-Röhrchen vor und legen Sie ein 40-μm-Zellsieb auf jedes Röhrchen, durch das die Einzelzellsuspension hergestellt wird.
HINWEIS: (i) Der Rührschritt entfernt den verbleibenden Darminhalt, Schleim und Zelltrümmer, die die Lebensfähigkeit der Zellen und die Erholung von PP-Lymphozyten verringern, wenn sie nicht entfernt werden. (ii) Wenden Sie keine Verdauungsenzyme auf PP-Gewebe an, da der Verdauungsprozess einen dramatischen Verlust der CXCR5-Expression von der Zelloberfläche verursacht.
- Nach dem Rühren werden die PPs in das 40-μm-Zellsieb überführt, das auf den neu vorbereiteten konischen 50-ml-Röhrchen platziert ist. Mit der abgerundeten Seite eines 10-ml-Spritzenkolbens die PPs vorsichtig durch das Zellsieb aufbrechen, um eine Einzelzellsuspension zu erzeugen. Spülen Sie das Sieb mit 15–20 mL kalter RPMI + 10 % FBS.
HINWEIS: (i) Vor dem Filtern die Röhrchen mit den PP horizontal schütteln. Dieser kurze Shake erleichtert den Transfer von PPs in Zellsiebe. (ii) Die Verwendung eines 70-μm-Zellsiebs für die Isolierung von nicht-lymphoiden Immunzellen (z. B. Monozyten, Makrophagen, DCs) wird empfohlen.
- Die einzelligen Suspensionen werden bei 350–400 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugiert.
- Der Überstand wird vorsichtig entsorgt und die Zellen in einer Konzentration von 10 x 106 Zellen/ml resuspendiert. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer.
