Isolierung von mononukleären Zellen des peripheren Blutes aus menschlichen Buffy Coats

Zusammenfassung

Quelle: Mily, A., et al. Polarisation von M1- und M2-Zellen aus humanen Monozyten und Analyse mit Durchflusszytometrie bei Mycobacterium tuberculosis-Infektion. J. Vis. (2020)

In diesem Video demonstrieren wir die Isolierung von mononukleären Zellen des peripheren Blutes, PBMCs, die Monozyten und Lymphozyten enthalten, aus einem menschlichen Buffy-Coat durch Dichtegradientenzentrifugation. Die isolierten PBMCs können für weitere Analysen verwendet werden.

Protokoll

Alle Eingriffe mit menschlichen Teilnehmern wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien für das Wohlergehen des Menschen durchgeführt und vom lokalen institutionellen Prüfungsausschuss überprüft.

>1. Vorbereitung der Medien

HINWEIS: Details zu allen Reagenzien und Verbrauchsmaterialien finden Sie in der Materialtabelle.

1. RPMI Complete Medium: Ergänzen Sie RPMI 1640 mit 1 mM Natriumpyruvat, 2 mM L-Glutamin, 10 mM HEPES und 10% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS). Vermeiden Sie Antibiotika im Zellkulturmedium, wenn Sie mit einer Mtb-Infektion arbeiten.
2. Serumfreies RPMI-Medium: Ergänzen Sie RPMI 1640 mit 1 mM Natriumpyruvat, 2 mM L-Glutamin und 10 mM HEPES.

>2. Isolierung mononukleärer Zellen aus peripherem Blut

HINWEIS: Führen Sie alle Arbeiten mit menschlichem Blut (potenziell ansteckend) in einer Biosicherheitswerkbank der Klasse II durch. Inaktivieren Sie die Reste von Blutprodukten 15 Minuten lang mit Desinfektionsmitteln, bevor Sie sie entsorgen. In diesem Fall wurde Blut von gesunden Freiwilligen gewonnen. Dieses in vitro Makrophagen-Differenzierungsprotokoll wurde so eingerichtet, dass es 10 x 10⁶ isolierte PBMCs/Spender/Well umfasst. Von jedem Spender enthält ein Buffy Coat etwa 50 ml einer konzentrierten Leukozytensuspension, die aus Vollblut stammt und normalerweise 500–800 x 10⁶ PBMCs liefert, aus denen etwa 10% oder 50–80 x 10⁶ Monozyten entnommen werden können.

1. 15 ml Buffy-Coat-Blut auf 15 ml Dichtegradientenmedium in einem 50-ml-Röhrchen auffüllen. Überlagern Sie langsam die Dichtegradientenschicht mit Blut, indem Sie die Pipettenspitze an die Wand des Röhrchens lehnen.
2. Die Röhren bei 600 x g für 25 min bei Raumtemperatur (RT) mit 0 Beschleunigung und 0 Verzögerung drehen.
   Anmerkung: Schließen Sie die Deckel vor der Zentrifugation sorgfältig und überprüfen Sie die Röhrchenhalter nach der Zentrifugation immer auf mögliches Überlaufen.
3. Entfernen Sie die oberste Plasmaschicht mit einer sterilen Pasteurpipette und sammeln Sie danach die mononukleäre Zellschicht vorsichtig mit einer sterilen Pasteurpipette in ein neues 50-ml-Röhrchen. Fügen Sie dem PBMC-Pellet serumfreies RPMI-Medium hinzu, um ein Endvolumen von 50 ml zu erhalten. Mischen Sie vorsichtig, indem Sie das Röhrchen einige Male umdrehen, bevor Sie es bei 500 x g für 5 min bei RT zentrifugieren.
4. Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig und resuspendieren Sie das Zellpellet, indem Sie den Boden des Röhrchens mit den Fingern umdrehen.
5. Um die Kontamination des Dichtegradientenmediums von den PBMCs zu entfernen, waschen Sie die Zellen 2–3 Mal mit serumfreiem RPMI, um ein Endvolumen von 50 ml zu erhalten. Bei 500 x g 5 min bei RT zentrifugieren. Waschen, bis der Zellüberstand transparent wird.
6. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 20 ml serumfreiem RPMI-Medium.
7. Zählen Sie die Zellen durch Trypanblau-Färbung, manuell mit einem Hämozytometer oder mit einem automatisierten Zellzähler. Verdünnen Sie die Zellsuspension in Trypanblau in einer Verdünnung von 1:2 oder 1:10, indem Sie die Zell-Trypanblau-Probe in einer 96-Well-Platte mischen, z. B. 50 μl + 50 μl (für die Hämozytometerzählung) oder 10 μl + 10 μl (für die automatisierte Zellzählung) und zählen Sie die Zellen, um die Anzahl der lebenden Zellen/ml zu erhalten
   Vorsicht: Trypanblau ist giftig und muss in einem separaten chemischen Abfall entsorgt werden.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Lymphoprep	Alere Technologies AS	11508545
RPMI 1640	Life Technologies Corporation	SH30096.01
EDTA (0,5 Mio.)	Karolinska Universitätskrankenhaus, Huddinge	N/A
Na-Pyruvat	GE Healthcare Life Sciences	SH300239.01
L-Glutamin	GE Healthcare Life Sciences	SH30034.01
HEPES	GE Healthcare Life Sciences	SH30237.01
Fötales Rinderserum (FBS)	Sigma-Aldrich	Nr. F7524