Alle Eingriffe mit menschlichen Teilnehmern wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien für das Wohlergehen des Menschen durchgeführt und vom lokalen institutionellen Prüfungsausschuss überprüft.
>1. Differenzierung und Polarisation von Monozyten-abgeleiteten Zellen
- Verwenden Sie plastische Adhärenz zur Isolierung von Monozyten. Kurz gesagt, frisch isolierte mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) in einer 6-Well-Kulturplatte in einer geeigneten Konzentration säen, z. B. 10 x 106 PBMCs/Well in 2 mL serumfreiem RPMI-Medium (Supplement RPMI 1640 mit 1 mM Natriumpyruvat, 2 mM L-Glutamin und 10 mM HEPES) und inkubieren bei 37 °C und 5 % CO2.
- Entfernen Sie nach 2–3 h die nicht adhärenten Zellen mit einer Pipette und waschen Sie die Wells 3 Mal mit 1 mL serumfreiem Medium. Die angehängten Zellen sind Monozyten und machen etwa 10 % der gesamten PBMCs aus, die dem Well zugesetzt werden, d. h. 106 Monozyten, die aus 10 x 106 PBMCs gewonnen werden, die pro Well hinzugefügt wurden.
- Für die Makrophagendifferenzierung ist eine Arbeitslösung mit 50 ng/ml GM-CSF oder M-CSF für die M1- bzw. M2-Makrophagenpolarisation herzustellen und in 2 ml RPMI-Komplettmedium pro Vertiefung zuzugeben. Kultivieren Sie die Zellen in einem 5%igen CO2 -Inkubator bei 37 °C für 3 Tage.
- Entnehmen Sie an Tag 3 vorsichtig 1 ml des Zellkulturmediums aus der obersten Schicht jeder Vertiefung und ergänzen Sie die Zellkulturen mit 1 ml frischem RPMI-Komplettmedium, das die doppelte Konzentration von M-CSF oder GM-CSF enthält, um eine Endkonzentration von 50 ng/ml in den Vertiefungen zu erhalten. Geben Sie die Wachstumsfaktoren in eine vorgefertigte Arbeitslösung von 100 ng/ml/Well.
- Fügen Sie an Tag 6 für die letzten 18–20 Stunden der Zelldifferenzierung verschiedene Stimuli hinzu, um vollständig polarisiertes und reifes M1 (Interferon-γ; IFN-γ und Lipopolysaccharid; LPS (E. coli O55:B5)) oder M2 (Interleukin 4; IL-4)-Makrophagen. Für die M1-Polarisation bereiten Sie IFN-γ und LPS in RPMI-Vollmedium vor (Ergänzen Sie RPMI 1640 mit 1 mM Natriumpyruvat, 2 mM L-Glutamin, 10 mM HEPES und 10 % hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS)) und fügen Sie 50 μl pro Vertiefung hinzu, um eine Endkonzentration von 50 ng/mL IFN-γ und 10 ng/ml LPS in den Zellkulturen zu erhalten. Für die M2-Polarisation bereiten Sie IL-4 in RPMI-Vollmedium vor und fügen Sie 50 μl pro Vertiefung hinzu, um eine Endkonzentration von 20 ng/ml in den Zellkulturen zu erhalten.
- Zur Differenzierung von M0-polarisierten Makrophagen stimulieren Sie die Zellen nur mit M-CSF, ohne zusätzliche Zytokine (was zu einem M2-ähnlichen Phänotyp führt).
- Überprüfen Sie die Morphologie von Monozyten-abgeleiteten Zellkulturen regelmäßig mit Lichtmikroskopie, um sicherzustellen, dass kleinere Monozyten zu größeren Makrophagen-ähnlichen Zellen differenziert werden. Überwachen Sie auch mögliche morphologische Unterschiede zwischen der M1- und M2-Polarisation, d. h. längliche und gestreckte M1-Zellen im Vergleich zu M2-Zellen mit einer abgerundeteren Form.
