Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Vorbereitung von AC-6 Feederzellen
Hinweis: Die stromale Zelllinie AC-6.21 (kurz AC-6) (zur Verfügung gestellt von I. Weissman, Stanford University) sollte in RPMI gehalten werden, ergänzt mit 15% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS). Um als Feeder-Zellen zu dienen, werden AC-6-Zellen einen Tag vor der Co-Kultur mit 3.000 rad (30Gy) γ bestrahlt, um ihre Proliferation zu verhindern. Beachten Sie, dass AC-6-Zellen dazu neigen, ihre differenzierungsunterstützende Fähigkeit zu verlieren, wenn sie während der Wartung überfüllt bleiben oder wenn ihre Passagezahl über 20 liegt.
- Waschen Sie die AC-6-Zellen einmal mit 1 ml Dulbecco-Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (DPBS) und entfernen Sie DPBS durch Aspiration. AC-6-Zellen mit 0,8 ml Trypsinlösung (0,05 % Trypsin und 0,5 mM EDTA in DPBS) für 3-5 min bei 37°C, 5 % CO2 behandeln und dann die Reaktion stoppen, indem sie mit 10 Volumen Kulturmedium verdünnt werden, um eine Einzelzellsuspension herzustellen.
- AC-6-Zellen bei 5,9 x 104 Zellen/Well in 12-Well-Platten aussäen und bei 37°C, 5 % CO2 O/N.
inkubieren
Anmerkung: Die Dichte der AC-6-Zellen ist sehr wichtig, da eine geringere Dichte die cDC-Erzeugung begünstigt. Die Aussaat bei einer Dichte von 5,9x104 Zellen/Well ermöglicht es AC-6, am nächsten Tag die Konfluenz zu erreichen, was optimal für die Ableitung von pDCs aus CLPs ist.
- Bestrahlen Sie AC-6-Zellen mit 3.000 rad (30 Gy) mit γ-irradiator.
Hinweis: Die Dosis, die zur Bestrahlung von AC-6 verwendet wird, ist optimiert, um eine Proliferation der Zellen zu verhindern und sie dennoch lange genug lebensfähig zu halten, um die Zytokine und den Zell-Zell-Kontakt bereitzustellen, die für die Unterscheidung von DCs und CLPs erforderlich sind.
- Medium aspirieren und durch 1 ml vollständiges RPMI ersetzen (RPMI mit 10 % hitzeinaktiviertem FBS, 50 μg/ml Gentamycin und 50 μM β-Mercaptoethanol).
>2. Isolierung von BM-Zellen aus Mäusen
- Opfern Sie Mäuse durch CO2 -Erstickung und Gebärmutterhalsluxation. Legen Sie die Mäuse auf ein Seziertablett und sterilisieren Sie sie mit 70% Ethanol. Machen Sie einen Schnitt in der Mitte des Bauches und entfernen Sie die Haut vom distalen Teil der Maus, einschließlich der Haut, die die unteren Extremitäten bedeckt.
- Präparieren Sie Mäuse in einer halbsterilen Haube. Um den Oberschenkelknochen und die Tibien zu lösen, wird der Femur oberhalb und die Tibien unterhalb des Kniegelenks abgeschnitten. Löse die Muskeln mit einer Schere von den Knochen und lege die Knochen in eine 6 cm große Petrischale mit 5 ml vollständigem RPMI.
- Wechseln Sie zu einer sterilen Kulturhaube. Füllen Sie eine 3-ml-Spritze, die mit einer 27G-Nadel verbunden ist, mit vollständigem RPMI. Schneiden Sie beide Enden der Knochen mit einer Schere ab und führen Sie die 27G-Nadel ein, um das Mark aus den Knochen zu spülen, indem Sie das vollständige RPMI einmal vorsichtig an jedem Ende injizieren.
- Bereiten Sie eine Einzelzellsuspension vor, indem Sie die Zellen mit der Spritze ohne Nadel 3-5 Mal vorsichtig in der Kulturschale auf und ab pipettieren.
- Die Zellen werden 5 min lang bei 500 x g zentrifugiert und der Überstand dekantiert.
- Lysieren Sie die roten Blutkörperchen mit 1 ml ACK-Puffer (150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0,1 mM EDTA), inkubieren Sie sie 1 Minute lang und stoppen Sie die Reaktion durch Verdünnung mit 10 Volumina vollständigem RPMI. Lassen Sie die Zellen 5 Minuten stehen, um abgestorbene Zellklumpen und Gewebetrümmer durch die Schwerkraft zu zerkleinern.
Anmerkung: Stehen Sie nicht länger als 5 Minuten, da dies zu Zellverlust aufgrund der Ansiedlung lebensfähiger Zellen führt.
- Dekantieren Sie den zellhaltigen Überstand langsam in ein neues Röhrchen, wobei Ablagerungen im ursprünglichen Röhrchen zurückbleiben.
- 5 min bei 500 x g zentrifugieren, um die Zellen zu pelletieren, dann den Überstand entfernen und entsorgen.
- Resuspendieren Sie die Gesamt-BM-Zellen (typischerweise werden 4-6 x 10 7 BM-Zellen aus einer Maus gewonnen) in 100 μl FACS-Puffer (1x PBS+ 2% FBS+ 1mM EDTA).
>3. FACS-Analyse und Sortierung von CLPs
- Anti-CD16/32 (Hybridom-Supernant-Klon 2.4G2, 50 μl/Reaktion oder 1-2 μg/Reaktion) für 1-2 min in Zellen in FACS-Puffer (Schritt 2.9) geben, um die Fc-Rezeptoren zu blockieren.
Anmerkung: Anti-CD16/32 wird auch als Fc-Block bezeichnet, der hinzugefügt wird, um die unspezifische Bindung von Antikörpern an Zellen zu verhindern, die Fc-Rezeptoren exprimieren, einschließlich Granulozyten, Monozyten und B-Lymphozyten.
- Färben Sie die Zellen gleichzeitig mit den folgenden fluoreszierenden Farbstoff-markierten Antikörpern (für 4x107 Zellen) für 15 Minuten auf Eis, wobei Sie Umgebungslicht vermeiden. Antikörper: PE-konjugierte Linienmarker (0.) jeweils 2 μg), einschließlich Anti-CD3 (17A2), Anti-CD8 (53-6,7), Anti-B220 (RA3-6B2), Anti-CD19 (eBio1D3), Anti-CD11b (M1/70), Anti-Gr-1 (RB6-8C5), Anti-Thy1.1 (HIS51), Anti-NK1.1 (PK136), Anti-TER119 (TER-119) und Anti-MHC-II (NIMR-4), 0,2 μg Anti-c-Kit-PerCP-Cy5.5 (2B8), 1 μg Anti-Sca-1-FITC (D7), 0,4 μg Anti-M-CSFR-APC (AFS98) und 0,2 μg anti-IL-7Rα-PE-Cy7 (A7R34).
- Die Zellen mit 3 ml FACS-Puffer waschen und 5 min bei 500 x g zentrifugieren.
- Resuspendieren Sie die Zellen in 300 μl FACS-Puffer und filtrieren Sie die Zellen durch ein 40 μM Zellsieb.
- Waschen Sie das Röhrchen mit einem zusätzlichen 100 μl FACS-Puffer, um alle verbleibenden Zellen zurückzugewinnen, und filtrieren Sie es mit demselben Zellsieb in ein steriles FACS-Sortierröhrchen.
- Führen Sie unmittelbar nach der Färbung eine durchflusszytometrische Analyse mit geeigneten Filtern und Spannungen für die Signaldetektion durch. Verwenden Sie einen 488-nm-Laser zum Nachweis der FITC-, PerCP-Cy5.5-markierten Antikörper, einen 561-nm-Laser zum Nachweis der PE- und PE-Cy7-markierten Antikörper und einen 633-nm-Laser zum Nachweis des APC-markierten Antikörpers.
- Sortieren Sie CLPs nach den folgenden Markern: lin-c-kit,int, Sca-1,int, M-CSFR-IL-7Rα+ (wie in Schritt 3.2 gefärbt), mit einem Zellsortierer. Sammeln Sie die sortierten Zellen in einem 15-ml-Röhrchen mit 8 ml vollständigem RPMI als Kissen.
- Notieren Sie die absolute Anzahl der sortierten Zellen, wie sie vom Zellsortierer am Ende des Laufs angezeigt wird. In der Regel können 5x104 CLPs aus dem BM einer Maus gewonnen werden.
4. Kokultur-CLPs und AC-6
- Die sortierten Zellen aus Schritt 3.7 werden 10 Minuten lang bei 500 x g zentrifugiert, der Überstand entfernt und das Zellpellet mit genügend vollständiger RPMI resuspendiert, um eine Zelldichte von etwa 5 x 104 Zellen/ml zu erhalten. 500 Zellen/Vertiefung werden in die 12-Well-Platte mit den in Schritt 1.4 vorbereiteten Feederzellen eingesät.
- Zugabe von 100 ng/ml FL (hu-Flt3L-Ig, intern erzeugt mit einem Expressionssystem von M. Manz, Universitätsspital Zürich, Schweiz) und Inkubation bei 37°C, 5 % CO2 mit regelmäßiger visueller Überwachung der DC-Entwicklung unter einem Mikroskop.
Anmerkung: Im Handel erhältliches rekombinantes humanes FL oder Maus-FL kann als Ersatz für hu-Flt3L-Ig verwendet werden, um die DC-Entwicklung zu unterstützen.
- Sammeln Sie die Zellen am Tag 12 im Überstand und waschen Sie die Vertiefungen einmal mit 0,5 ml vollständigem RPMI-Medium, indem Sie die resultierenden Überstände kombinieren. Fügen Sie 0,5 ml frisches Medium hinzu und kratzen Sie die adhärenten Zellen mit einem Zellschaber ab.
- Kombinieren Sie das zellhaltige Medium aus beiden Teilen und zentrifugieren Sie es für 5 min bei 500 x g.
- Überstand dekatieren und resuspendieren Sie die Zellen in 50 μl FACS-Puffer. 50 μl Anti-CD16/32-Hybridom-Überstand zugeben und 1-2 Minuten inkubieren, um die Fc-Rezeptoren zu blockieren.
- Zählen Sie alle Zellen auf und färben Sie sie mit den folgenden Antikörpern (je 0,05 μg): anti-CD11c-APC (N418), anti-CD11b-FITC und anti-B220-PE.
- Die Zellen werden wie in Schritt 3.3 beschrieben gewaschen und zentrifugiert.
- Resuspendieren Sie die Zellen in 100 μl FACS-Puffer, gattern Sie auf CD11c+ und analysieren Sie sie auf cDCs (CD11c+CD11b+B220-) und pDCs (CD11c+CD11b-B220+).