Alle Eingriffe mit menschlichen Teilnehmern wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien für das Wohlergehen des Menschen durchgeführt und vom lokalen institutionellen Prüfungsausschuss überprüft.
>1. Isolierung von mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs)
- Vorbereitung des Reagenzes
- Bereiten Sie PBS/EDTA vor: phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) und ergänzen Sie es mit 2 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA). Sterilisieren Sie diese Lösung durch Filtration durch einen 0,2 μm Filter. HINWEIS: PBS/EDTA vor Gebrauch bei 4 °C lagern und auf Raumtemperatur erwärmen.
- Färbepuffer vorbereiten: Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit 2 % fötalem Rinderserum (FBS), 10 mM 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethensulfonsäure (HEPES) und 2 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA). Sterilisieren Sie diese Lösung durch Filtration durch einen 0,2 μm Filter.
- Sammle Blut von Blood Cone
Anmerkung: Der Blutkegel enthält Bestandteile weißer Blutkörperchen, die nach der Thrombozytenpherese aus dem Krankenhaus entnommen wurden. Wenn Blut in Heparin- oder EDTA-Röhrchen entnommen wird, verdünnen Sie das Blut mit PBS im Verhältnis 1:1 und fahren Sie mit Schritt 1.3 fort. Wenn Sie einen Buffy Coat erhalten, verdünnen Sie den Buffy Coat mit PBS im Verhältnis 1:2 und fahren Sie mit Schritt 1.3 fort.
- Schneiden Sie die beiden Enden des Kegels ab, damit das Blut in ein 50-ml-Röhrchen fließen kann.
Beachten Sie, dass der Kegel normalerweise 10 ml Blut enthält.
- Verwenden Sie eine Spritze mit stumpfen Enden, die 30 ml PBS/EDTA enthält, um den Kegel zu waschen und in einer 50-ml-Tube aufzufangen.
- Verdünnen Sie das Blut weiter mit PBS/EDTA bis zu einem Endvolumen von 80 ml.
- Isolierung von PBMCs durch Dichtezentrifugation
- Aliquotieren Sie je 15 ml Ficoll auf 4 frische 50 ml Röhrchen.
- Verwenden Sie eine serologische 25-ml-Pipette, um 20 ml verdünntes Blut über die Ficoll-Schicht zu geben. Achten Sie darauf, die 50 ml Tube in einem 45° Winkel zu halten und darauf zu achten, die Zwischenphase nicht zu stören.
- Die Röhrchen bei 805 x g ohne Bremsen 30 min, 20 °C zentrifugieren.
- Entfernen Sie die Plasmaschicht und sammeln Sie den direkt unter der Plasmaschicht liegenden PBMC-Ring mit einer Pasteurpipette. Kombinieren Sie vier Röhrchen PBMC in zwei 50-ml-Röhrchen. Beachten Sie, dass Sie die transparente Schicht nicht unter den PBMCs sammeln sollten.
- PBS/EDTA zu einem Endvolumen von 50 ml pro Tube PBMC zugeben und bei 548 x g mit Bremsen für 10 min, 20 °C zentrifugieren.
- Überstand aspirieren und resuspendieren Sie das Pellet in jedem Röhrchen mit 25 ml Färbepuffer und kombinieren Sie es in einem 50 ml Röhrchen.
- Zentrifugieren bei 367 x g mit Bremsen für 5 min, 4 °C.
- Überstand aspirieren und Pellet mit 10 ml Färbepuffer resuspendieren.
>2. Monozytenanreicherung durch magnetische Trennung
- Ermitteln der Zellzahl
- Nehmen Sie 20 μl PBMC-Zellsuspension und mischen Sie sie mit 20 μl Trypanblau, um die Anzahl der lebenden Zellen mit einem Zytometer zu zählen.
- Zentrifugenzellensuspension bei 367 x g mit Bremsen für 10 min, 4 °C.
- Der Überstand wird vollständig aspiriert und das Zellpellet auf eine Konzentration von 107 Zellen pro 80 μl Färbepuffer resuspendiert.
- Magnetische Beschriftung
- 20 μl CD14-Mikrokügelchen pro 107 Zellen zugeben, gut mischen und 15 min bei 2 - 8 °C inkubieren.
- Die Zellen werden durch Zugabe von 1 ml Färbepuffer pro 107 Zellen gewaschen und bei 367 x g mit Bremsen für 10 min, 4 °C zentrifugiert.
- Der Überstand wird vollständig aspiriert und das Zellpellet in einer Konzentration von 107 Zellen pro 50 μl Färbepuffer resuspendiert.
- Magnetische Trennung
- Verwenden Sie eine mittelgroße Spalte für maximal 2 x 10 bisinsgesamt 8 Zellen.
Anmerkung: Wählen Sie eine geeignete Spalte und ein Trennzeichen entsprechend der Anzahl der Gesamtzellen und der im Datenblatt empfohlenen Anzahl der CD14+-Zellen.
- Stellen Sie die Säule in das Magnetfeld eines geeigneten Separators und bereiten Sie die Säule vor, indem Sie sie mit 500 μl Färbepuffer spülen.
- Pipettieren Sie die Zellsuspension auf die Säule und sammeln Sie unmarkierte Zellen, die die Säule mit einem 15-ml-Röhrchen passieren.
- Setzen Sie ein neues 15-ml-Röhrchen unter die Säule und waschen Sie die Säule 3 Mal mit 500 μl Färbepuffer. Stellen Sie sicher, dass der Säulenbehälter leer ist, bevor Sie zwischen den Wäschen einen neuen Färbepuffer hinzufügen.
- Nehmen Sie die Säule aus dem Separator und stellen Sie sie auf ein frisches 15-ml-Röhrchen.
- Pipettieren Sie 1 ml Färbepuffer auf die Säule. Spülen Sie die magnetisch markierten Zellen sofort aus, indem Sie den Kolben (im Kit enthalten) fest in die Säule drücken.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.3.2 bis 2.3.6 mit der eluierten Fraktion auf einer neuen Säule, um die Reinheit der CD14+-Zellen zu erhöhen. Beachten Sie, dass die Kügelchen in Schritt 3.2 in Kultur automatisch aus den Zellen freigesetzt werden.
>3. Differenzierung dendritischer Zellen zu verschiedenen Aktivierungszuständen
- Vorbereitung des Reagenzes (der Endotoxingehalt muss in allen Reagenzien weniger als 0,1 EU/ml betragen)
- Bereiten Sie das Zellkulturmedium vor: RPMI 1640, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS), 1 % nicht-essentiellen Aminosäuren (NEAA) und 0,05 mM 2-Mercaptoethanol (2ME). Sterilisieren Sie diese Lösung durch Filtration durch einen 0,2 μm Filter.
- Zytokine vorbereiten: IL-4 und GM-CSF in Wasser in Zellkulturqualität bis zu einer Konzentration von 0,25 mg/ml unter aseptischen Bedingungen rekonstituieren. Aliquotieren Sie Zytokine in 200 μl Mikrozentrifugenröhrchen und lagern Sie sie bei -80 °C.
- Bereiten Sie Vitamin-D3-Brühe vor: Rekonstituieren Sie Vitamin D3 in Wasser in Zellkulturqualität auf eine Konzentration von 100 mM unter aseptischen Bedingungen. Vitamin D3 in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen aliquotieren und bei -20 °C lagern.
- Dexamethason-Stamm vorbereiten: Dexamethason in Wasser in Zellkulturqualität unter aseptischen Bedingungen auf eine Konzentration von 10 mM rekonstituieren. Dexamethason aliquot in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen abfüllen und bei -20 °C lagern.
- LPS vorbereiten: Lipopolysaccharide (LPS) in Wasser in Zellkulturqualität unter aseptischen Bedingungen auf eine Konzentration von 1 mg/ml rekonstituieren. LPS in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen aliquotieren und bei -20 °C lagern.
- Generieren unterschiedlicher moDCs
- 4 Sätze CD14+-Monozyten in einer Konzentration von 0,3 - 0,5 x 106/ml Zellkulturmedium aussäen, ergänzt mit 200 ng/ml GM-CSF und 200 ng/ml IL-4 in 6-Well-Platten. Beachten Sie, dass dies Tag 0 ist und das Volumen des Mediums in jeder 6-Well-Vertiefung 2 ml beträgt.
- Inkubieren Sie die Zellen in einem Gewebekultur-Inkubator bei 37 °C mit 5 % CO2.
- An Tag 4 werden 850 μl Medium aus der Kultur entnommen und bei 300 x g für 5 min, 4 °C zentrifugiert. Das Pellet wird in 1 ml Zellkulturmedium aspiriert und resuspendiert, das 2x (200 ng/ml GM-CSF und 200 ng/ml IL-4) enthält. Geben Sie diese Zellmischung wieder in die Kultur. Beachten Sie, dass die 2-fache Konzentration, die für GM-CSF und IL-4 hinzugefügt wird, zu 1x wird, wenn die 1 ml des Mediums wieder in die Kultur gegeben wird.
- Fügen Sie an Tag 5 1 μl Vitamin-D3-Stamm und 1 μl Dexamethason-Stamm pro ml Medium zu zwei der Sets hinzu, um tolerogene moDCs zu erzeugen. Beachten Sie, dass die Endkonzentration von Vitamin D3 100 nM und von Dexamethason 10 nM beträgt. die Zugabe von GM-CSF und IL-4 ist an Tag 5 nicht erforderlich.
- Fügen Sie 200 ng/ml GM-CSF und 200 ng/ml IL-4 zu allen Sets an Tag 6 hinzu.
- Geben Sie 1 μg/ml LPS zu einem der Sets, die an Tag 6 nur mit GM-CSF und IL-4 behandelt wurden, um reife moDCs zu erzeugen.
- Fügen Sie an Tag 6 1 μg/ml LPS zu einem Satz der tolerogenen moDCs hinzu, um LPS-tolerogene moDCs zu erzeugen.
- Ernten Sie die verschiedenen Arten von moDCs an Tag 7, indem Sie die Kulturschale mit PBS, EDTA für die Durchflusszytometrie oder andere Studien spülen. Beachten Sie, dass nur nicht-adhärente Zellen geerntet werden. Beachten Sie, dass die prozentuale Ausbeute von CD14+-Monozyten für unreife moDCs, reife moDCs, tolerogene moDCs und LPS-tolerogene DCs etwa 90 %, 50 %, 60 % bzw. 60 % beträgt und zwischen Blutspendern und FBS-Chargen variiert.
