Isolierung und Reinigung von B-Zellen aus menschlichem peripherem Blut

Zusammenfassung

Quelle: Tzeng, S. J. Die Isolierung, Differenzierung und Quantifizierung von humanen Antikörper-sezernierenden B-Zellen aus dem Blut: ELISpot als funktionelle Auslesung der humoralen Immunität. J. Vis. Exp. (2016)

In diesem Video demonstrieren wir die Isolierung von B-Zellen aus menschlichem peripherem Blut mit biotinylierten Antikörpern, die spezifisch für Nicht-B-Zellen sind, und Streptavidin-konjugierten magnetischen Mikrokügelchen.

Protokoll

Alle Eingriffe mit menschlichen Teilnehmern wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien für das Wohlergehen des Menschen durchgeführt und vom lokalen institutionellen Prüfungsausschuss überprüft

>1. Isolierung und Reinigung von menschlichen peripheren Blut-B-Zellen

1. Ziehen Sie ~ 10 ml Blut aus der Vena cubitalis medianus (in der Fossa cubitalis vor dem Ellenbogen) in ein 15-ml-Röhrchen mit K₂EDTA (1,5 bis 2,0 mg/ml Blut) und drehen Sie das Röhrchen sofort mehrmals um, um die Bildung von Blutgerinnseln zu verhindern.
2. Geben Sie 35 ml autoklavierten (121 °C, 15 min) Lysepuffer für rote Blutkörperchen (RBC) (150 mM NH₄Cl, 10 mM KHCO₃ und 1 mM EDTA; pH 7,4) in das Röhrchen mit der frischen Blutprobe (≥ 3:1 vol/vol) und inkubieren Sie es nicht länger als 5 Min. bei Raumtemperatur (RT<> Anmerkung: Das Auftreten einer Lichtdurchlässigkeit durch das Rohr zeigt den Abschluss der Erythrozytenlyse an.
3. Zentrifugieren Sie bei 600 x g bei RT für 5 min. Stellen Sie sicher, dass das Pellet eine weiße Farbe hat.
4. Das Pellet wird mit 10 mL autoklavierter, phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 4,3 mM Na₂HPO₄ und 1,47 mM KH₂PO₄; pH 7,4) resuspendiert und wie in Schritt 1.3 zentrifugiert.
5. Entsorgen Sie den Überstand, resuspendieren Sie das Pellet mit 10 ml RPMI 1640 Medium (Nahrungsergänzungsmittel: 10 % fötales Kälberserum, 100 μg/ml Penicillin/Streptomycin, 0,25 μg/ml Amphotericin B und 2 mM L-Glutamin) und geben Sie die Zellen dann in eine 10-cm-Kulturschale (10 ml Blut pro Schale). Das Gericht für 30 min in einen 37 °C heißen Inkubator mit 5 % CO₂ stellen.
6. Schwenken Sie die Kulturschale einige Male vorsichtig und geben Sie das Kulturmedium (Suspensionszellen) in konische 15-ml-Kunststoffröhrchen. Entsorgen Sie die adhärenten Zellen (meist Makrophagen) auf den Kulturschalen.
7. Bei 600 x g bei RT 5 min zentrifugieren. Den Überstand verwerfen.
8. Resuspendieren Sie das Pellet mit 1 mL RPMI 1640 Medium. Zählen Sie die Zellzahl mit einem Hämozytometer oder einem automatischen Zellzähler.
   Anmerkung: Die Lebensfähigkeit isolierter Leukozyten beträgt normalerweise mehr als 90 % durch Trypanblau-Ausschluss.
9. Zentrifugieren Sie wie in Schritt 1.7 und resuspendieren Sie die Zellen in ~ 200 μl kaltem PBS-Puffer (0,5 % Rinderserumalbumin (BSA) und 2 mM EDTA) in einer Konzentration von 5 - 10 x 10⁶ Zellen/ml.
10. 5 μl biotinylierter Anti-Human-Ab-Cocktail spezifisch für Blutzellen (für die negative Selektion von B-Zellen) pro 10⁶ Zellen zugeben und 30 Min. auf Eis inkubieren< /> Anmerkung: Der Anti-Human-Ab-Cocktail sollte mindestens Bauchmuskeln enthalten, die für CD2 (oder CD3), CD14 und CD16 spezifisch sind.
11. Geben Sie ein 10-faches überschüssiges Volumen an sterilem PBS in die Zellen, zentrifugieren Sie 5 Minuten lang bei 600 x g und verwerfen Sie den Überstand.
12. Geben Sie die gleichen Mengen an Streptavidin-konjugierten Mikrokügelchen (5 μl pro 10⁶ Zellen) zum Pellet und mischen Sie es gründlich.
13. 30 Minuten lang auf Eis in einem konischen 15-ml-Kunststoffröhrchen inkubieren.
14. Geben Sie 2 ml PBS-Puffer in das Röhrchen.
15. Stellen Sie das Röhrchen in einen Magnetständer und inkubieren Sie es 8 Minuten lang bei RT. Die braunen Mikrokügelchen heften sich nach und nach an der Röhrenwand neben dem Magneten an.
16. Übertragen Sie den Überstand vorsichtig in ein neues steriles 15-ml-Röhrchen, während das Röhrchen im Magnetständer verbleibt.
17. Wiederholen Sie die Schritte 1.14 bis 1.16 und kombinieren Sie die beiden Überstände, die die unberührten B-Zellen enthalten. Entsorgen Sie die Mikrokügelchen.
18. Bei 600 x g bei RT 5 min zentrifugieren. Den Überstand verwerfen.
19. Resuspendieren Sie das Pellet in RPMI 1640 Medium für nachgeschaltete Experimente.
    Anmerkung: Typischerweise können 1 - 5 x 10⁵ B-Zellen mit einer Reinheit von mehr als 95 % aus 10 ml peripherem Blut isoliert werden.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
BD Vacutainer K2E	BD Biowissenschaften	367525	10 ml Tube
Ficoll-Paque Plus	GE Gesundheitswesen	Artikel-Nr.: 17-1440-02	Frei von Endotoxinen
Trypanblau 0,5% ige Lösung	Biologische Industrien	03-102-1B	färben
IMag Set zur Anreicherung humaner B-Lymphozyten	BD Biowissenschaften	558007	Reagenz
Streptavidin magnetische Mikrokügelchen	BD Biowissenschaften	9000810	Reagenz
15 ml Falcon Tuben	BD Falke	352196	Kunststoff-Ware
Biotinyliertes CD27 mAb	Biolegende	302804	Klonen O323
Biotinyliertes Anti-Human-CD27	Biolegende	302804	Klonen O323
Biotinyliertes Anti-Human-CD27	eBiowissenschaften	Artikel-Nr.: 13-0279-80	Klonen O323