Alle Eingriffe mit menschlichen Teilnehmern wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien für das Wohlergehen des Menschen durchgeführt und vom lokalen institutionellen Prüfungsausschuss überprüft.
>1. Zellsortierung für die Sammlung von naiven B-Zellen, Memory-B-Zellen und Plasmablasten/Plasmazellen (PBs/PCs)
- Bestimmen Sie die Zellzahl anhand von gereinigten B-Zellen aus dem peripheren Blut des menschlichen Blutes mit einem Hämozytometer oder einem automatischen Zellzähler.
- Die Zellen werden in kaltem PBS-Puffer in einer Konzentration von 107 pro ml in einem 5-ml-Polystyrolröhrchen resuspendiert.
- Fügen Sie 1 - 2 μg humanes IgG pro 106 Zellen hinzu und inkubieren Sie 10 Minuten lang auf Eis für den Fc-Block.
- Je 1 μg anti-CD19-APC (Klon: HIB19), anti-CD27-eFluor450 (Klon: O323) und anti-CD38-PE (Klon: HIT2) pro 106 Zellen zugeben, gut mischen und 30 Minuten auf Eis inkubieren.
- In den letzten 5 Minuten in Schritt 1.4 fügen Sie 5 μl des handelsüblichen 7-Amino-Actinomycin D (7-AAD) hinzu.
- Geben Sie 2 mL PBS in das Röhrchen, den Vortex und zentrifugieren Sie 5 Minuten lang bei 600 x g.
- Resuspendieren Sie die Zellen in Sortierpuffer (steriles PBS mit 2 % BSA und 2 mM EDTA) in einer Konzentration von 1 - 5 x 107 Zellen pro mL in einem 15-ml-Röhrchen.
- Filtern Sie die Zellen durch ein Nylon-Mesh-Zellsieb (40 μm Porengröße), um Zellklumpen zu entfernen.
- Trennen Sie die Zellen mit einem durchflusszytometrischen Sortierer, der mit drei Lasern ausgestattet ist: violett (405 nm), blau (488 nm) und rot (640 nm).
HINWEIS: Für die 3-Farben-Durchflusszytometrie ist der blaue Laser allein ausreichend.
- Sortieren Sie die Zellen in drei 15-ml-Röhrchen (mit 5 ml RPMI-Medium) für die gleichzeitige Entnahme von naiven B-Zellen (CD19+CD27-), Gedächtnis-B-Zellen (CD19+CD27+) und PBs/PCs (CD19+CD27+/hiCD38+).
Anmerkung: Sortierte naive und Memory-B-Zellen können weiter kultiviert werden.
