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Alle Eingriffe mit menschlichen Teilnehmern wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien für das Wohlergehen des Menschen durchgeführt und vom lokalen institutionellen Prüfungsausschuss überprüft.
Menschliches peripheres Blut muss von gesunden Spendern mit informierter Zustimmung gewonnen werden, und die Verwendung von Blutproben muss den genehmigten Richtlinien entsprechen, die von Überprüfungsgremien festgelegt wurden. In dieser Studie wurde das Protokoll zur Verwendung von menschlichem Blut in einer Demonstration der Ergebnisse der Durchflusszytometrie (Abbildung 1) und ELISpot-Assays (Abbildung 2) untersucht.
>1. Isolierung und Reinigung von menschlichen peripheren Blut-B-Zellen
- Ziehen Sie ~ 10 ml Blut aus der Vena cubitalis medianus (in der Fossa cubitalis vor dem Ellenbogen) in ein 15-ml-Röhrchen mit K2EDTA (1,5 bis 2,0 mg/ml Blut) und drehen Sie das Röhrchen sofort mehrmals um, um die Bildung von Blutgerinnseln zu verhindern.
- 35 ml autoklavierten (121 °C, 15 min) Lysepuffer der roten Blutkörperchen (RBC) (150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3 und 1 mM EDTA; pH 7,4) in das Röhrchen mit der frischen Blutprobe (≥ 3:1 vol/vol) geben und nicht länger als 5 min bei Raumtemperatur (RT) inkubieren.
Anmerkung: Das Auftreten einer Lichtdurchlässigkeit durch das Rohr zeigt den Abschluss der Erythrozytenlyse an.
- Zentrifugieren Sie bei 600 x g bei RT für 5 min. Stellen Sie sicher, dass das Pellet eine weiße Farbe hat.
- Das Pellet wird mit 10 mL autoklavierter, phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 4,3 mM Na2HPO4 und 1,47 mM KH2PO4; pH 7,4) resuspendiert und wie in Schritt 1.3 zentrifugiert.
- Entsorgen Sie den Überstand, resuspendieren Sie das Pellet mit 10 ml RPMI 1640 Medium (Nahrungsergänzungsmittel: 10 % fötales Kälberserum, 100 μg/ml Penicillin/Streptomycin, 0,25 μg/ml Amphotericin B und 2 mM L-Glutamin) und geben Sie die Zellen dann in eine 10-cm-Kulturschale (10 ml Blut pro Schale). Das Gericht für 30 min in einen 37 °C heißen Inkubator mit 5 % CO2 stellen.
- Schwenken Sie die Kulturschale einige Male vorsichtig und geben Sie das Kulturmedium (Suspensionszellen) in konische 15-ml-Kunststoffröhrchen. Entsorgen Sie die adhärenten Zellen (meist Makrophagen) auf den Kulturschalen.
- Bei 600 x g bei RT 5 min zentrifugieren. Den Überstand verwerfen.
- Resuspendieren Sie das Pellet mit 1 mL RPMI 1640 Medium. Zählen Sie die Zellzahl mit einem Hämozytometer oder einem automatischen Zellzähler.
Anmerkung: Die Lebensfähigkeit isolierter Leukozyten beträgt normalerweise mehr als 90 % durch Trypanblau-Ausschluss.
- Zentrifugieren Sie wie in Schritt 1.7 und resuspendieren Sie die Zellen in ~ 200 μl kaltem PBS-Puffer (0,5 % Rinderserumalbumin (BSA) und 2 mM EDTA) in einer Konzentration von 5 - 10 x 106 Zellen/ml.
- 5 μl biotinylierter Anti-Human-Ab-Cocktail spezifisch für Blutzellen (für die negative Selektion von B-Zellen) pro 106 Zellen zugeben und 30 Min. auf Eis inkubieren< />
Anmerkung: Der Anti-Human-Ab-Cocktail sollte mindestens Bauchmuskeln enthalten, die für CD2 (oder CD3), CD14 und CD16 spezifisch sind.
- Geben Sie ein 10-faches überschüssiges Volumen an sterilem PBS in die Zellen, zentrifugieren Sie 5 Minuten lang bei 600 x g und verwerfen Sie den Überstand.
- Geben Sie die gleichen Mengen an Streptavidin-konjugierten Mikrokügelchen (5 μl pro 106 Zellen) zum Pellet und mischen Sie es gründlich.
- 30 Minuten lang auf Eis in einem konischen 15-ml-Kunststoffröhrchen inkubieren.
- Geben Sie 2 ml PBS-Puffer in das Röhrchen.
- Stellen Sie das Röhrchen in einen Magnetständer und inkubieren Sie es 8 Minuten lang bei RT. Die braunen Mikrokügelchen heften sich nach und nach an der Röhrenwand neben dem Magneten an.
- Übertragen Sie den Überstand vorsichtig in ein neues steriles 15-ml-Röhrchen, während das Röhrchen im Magnetständer verbleibt.
- Wiederholen Sie die Schritte 1.14 bis 1.16 und kombinieren Sie die beiden Überstände, die die unberührten B-Zellen enthalten. Entsorgen Sie die Mikrokügelchen.
- Bei 600 x g bei RT 5 min zentrifugieren. Den Überstand verwerfen.
- Resuspendieren Sie das Pellet in RPMI 1640 Medium für nachgeschaltete Experimente.
Anmerkung: Typischerweise können 1 - 5 x 105 B-Zellen mit einer Reinheit von mehr als 95 % aus 10 ml peripherem Blut isoliert werden.
>2. Reinigung und Trennung von Gedächtnis- und naiven B-Zellen von isolierten B-Zellen
- Verwenden Sie Zellen, die aus Schritt 1 aufgereinigt wurden, und bestimmen Sie die Zellzahl mit einem Hämozytometer oder einem automatischen Zellzähler.
- Resuspendieren Sie die Zellen in 100 μl kaltem PBS-Puffer nach Zentrifugation bei 600 x g und RT für 5 min.
- 1 - 2 μg biotinyliertes CD27 mAb pro 106 Zellen zugeben und 30 min auf Eis inkubieren.
- Geben Sie 10 mL PBS-Puffer in das Röhrchen und zentrifugieren Sie 5 Minuten lang bei 600 x g.
- Den Überstand verwerfen und die Zellen in 50 μl PBS-Puffer resuspendieren.
- Geben Sie die gleichen Mengen magnetischer Streptavidin-Mikrokügelchen (1 - 2 μg/106 Zellen) in ein konisches 15-ml-Kunststoffröhrchen zu den Zellen.
- Gut mischen und 30 min auf Eis inkubieren.
- Geben Sie 2 - 3 ml PBS-Puffer in das Röhrchen.
- Legen Sie das Röhrchen in einen Magnetständer und inkubieren Sie es 8 Minuten lang bei RT, damit sich die braunen Mikrokügelchen an der Seite anheften können, die dem Magneten am nächsten liegt.
- Übertragen Sie mit dem Röhrchen im Magnetständer die Überstandsfraktion vorsichtig in ein neues steriles Röhrchen. Diese Fraktion enthält die angereicherten CD27-naiven B-Zellen.
- Geben Sie 5 ml in das Röhrchen mit den Mikrokügelchen und resuspendieren Sie die Mikrokügelchen (d. h. die angereicherte Fraktion der CD27+-Gedächtnis-B-Zellen).
- Zentrifugieren Sie bei 600 x g bei RT für 5 min. Resuspendieren Sie die Pellets mit RPMI 1640 Medium für die nachgeschalteten Versuche.
Anmerkung: Typischerweise können ~ 30 - 60% der B-Zellen als CD27+-Gedächtniszellen aus den PBMCs eines gesunden Spenders aufgereinigt werden.
>3. Zellsortierung für die Sammlung von naiven B-Zellen, Gedächtnis-B-Zellen und PBs/PCs
- Bestimmen Sie anhand der in Schritt 1 gereinigten Zellen die Zellzahl mit einem Hämozytometer oder einem automatischen Zellzähler.
- Die Zellen werden in kaltem PBS-Puffer in einer Konzentration von 107 pro ml in einem 5-ml-Polystyrolröhrchen resuspendiert.
- Fügen Sie 1 - 2 μg humanes IgG pro 106 Zellen hinzu und inkubieren Sie 10 Minuten lang auf Eis für den Fc-Block.
- Je 1 μg anti-CD19-APC (Klon: HIB19), anti-CD27-eFluor450 (Klon: O323) und anti-CD38-PE (Klon: HIT2) pro 106 Zellen zugeben, gut mischen und 30 Minuten auf Eis inkubieren.
- In den letzten 5 Minuten in Schritt 3.4 fügen Sie 5 μl des handelsüblichen 7-Amino-Actinomycin D (7-AAD) hinzu.
- Geben Sie 2 mL PBS in das Röhrchen, den Vortex und zentrifugieren Sie 5 Minuten lang bei 600 x g.
- Resuspendieren Sie die Zellen in Sortierpuffer (steriles PBS mit 2 % BSA und 2 mM EDTA) in einer Konzentration von 1 - 5 x 107 Zellen pro mL in einem 15-ml-Röhrchen.
- Filtern Sie die Zellen durch ein Nylon-Mesh-Zellsieb (40 μm Porengröße), um Zellklumpen zu entfernen.
- Trennen Sie die Zellen mit einem durchflusszytometrischen Sortierer, der mit drei Lasern ausgestattet ist: violett (405 nm), blau (488 nm) und rot (640 nm).
Anmerkung: Für die 3-Farben-Durchflusszytometrie reicht allein der blaue Laser aus.
- Die Zellen werden in drei 15-ml-Röhrchen (mit 5 ml RPMI-Medium) sortiert, um gleichzeitig naive B-Zellen (CD19+CD27-), Gedächtnis-B-Zellen (CD19+CD27+) und PBs/PCs (CD19+CD27+/hiCD38+) zu sammeln.
Anmerkung: Sortierte naive und Gedächtnis-B-Zellen können wie in Schritt 4 beschrieben kultiviert werden.
>4. In vitro Differenzierung von isolierten humanen CD19+ B-Zellen, CD19+CD27+ Gedächtnis-B-Zellen und CD19+CD27-naiven B-Zellen
- Bestimmen Sie anhand der in den Schritten 1.19, 2.10, 2.11 und 3.10 gereinigten Zellen die Zellzahl mit einem Hämozytometer oder einem automatischen Zellzähler.
- Resuspendieren Sie die Zellen mit RPMI 1640 Medium in einer Konzentration von 1 - 10 x 105 pro mL und aliquotieren Sie sie in die Vertiefungen einer 12-Well-Platte.
- Fügen Sie CpG (ODN 2006) bei 5 μg/106 Zellen/ml hinzu.
- Kultivieren Sie die Zellen in einem 37 °C heißen Inkubator mit 5 % CO2 für 5 Tage.
- Ernten Sie die Zellen aus jeder Vertiefung, geben Sie sie separat in 15-ml-Röhrchen, fügen Sie 5 ml PBS zu jedem Röhrchen hinzu und zentrifugieren Sie sie bei 600 x g und RT für 5 Minuten.
- Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer oder einem automatischen Zellzähler. Resuspendieren Sie die Zellen in einer Konzentration von 1 - 10 x 105 pro mL mit RPMI 1640 Medium.
>5. ELISpot-Assay
- 30 μl 35%iges Ethanol in destilliertem Wasser in jede Vertiefung der ELISpot-Platten für 30 s geben.
Anmerkung: Vermeiden Sie beim Pipettieren zu jeder Zeit, die Membran in den Vertiefungen zu berühren.
- Drehen Sie die ELISpot-Platten um, um das Ethanol zu entfernen.
- Geben Sie 150 μl autoklaviertes ddH2O in jede Vertiefung und inkubieren Sie sie 5 Minuten lang bei RT, um das restliche Ethanol abzuspülen; anschließend waschen Sie steriles PBS bei RT für 3 min.
Anmerkung: Die Schritte 5.1 bis 5.3 können je nach Herstellung der Platten optional sein.
- Geben Sie 50 μl 5 μg/ml polyklonales F(ab')2-Fragment von Anti-Human-Ig (IgG + IgM + IgA) (in PBS) in jede Vertiefung der ELISpot-Platten und inkubieren Sie sie bei 4 °C über Nacht (bevorzugt) oder 37 °C für 2 Stunden.
Anmerkung: Versiegeln Sie die Ränder der Platten bis zur Verwendung mit Parafilm.
- Drehen Sie die Platten um, um ungebundene Abs zu entfernen, fügen Sie 200 μl PBS in jede Vertiefung hinzu und inkubieren Sie sie zweimal für jeweils 3 Minuten bei RT.
- Geben Sie 200 μl PBS mit 5 % BSA (oder RPMI 1640 Medium) zur Blockierung in jede Vertiefung und inkubieren Sie sie 2 Stunden lang bei RT.
- Drehen Sie die Platten um, um den Blockierungspuffer zu entfernen. Waschen Sie jede Füllung zweimal mit 200 μl PBS, wie in Schritt 5.5.
- Geben Sie 100 μl RPMI 1640 Medium in jede Vertiefung und inkubieren Sie sie bei 37 °C.
- Wenn Sie bereit sind, die Zellen zu säen, drehen Sie die Platten um, um das RPMI 1640-Medium zu entfernen.
- Geben Sie 100 μl (5 x 104), 50 μl (2,5 x 104) und 25 μl (1,25 x 104) der Zellen (aus den Schritten 1.19, 2.10, 2.11, 3.10 und 4.6) in die Vertiefungen einer ELISpot-Platte. Mit RPMI 1640 Medium bringen Sie das Volumen auf 150 μl/Well.
Anmerkung: Empfohlen wird mindestens eine oder zwei 2-fache Serienverdünnungen für die Beschichtung der Zellen.
- Inkubieren Sie die Platten in einem 37 °C heißen Inkubator mit 5 % CO2 für 8 - 14 h. Vermeiden Sie es, die Platten während der Inkubation zu bewegen.
- Drehen Sie die Platten um, um die Zellen und das RPMI 1640-Medium zu entfernen.
- Fügen Sie 200 μl/Vertiefung PBS-T (PBS mit 0,05 % Tween 20) hinzu und inkubieren Sie sie 5 Mal bei RT, jedes Mal für 3 Minuten. Drehen Sie die Platte um, um den Waschpuffer zwischen jedem der 5 Waschgänge zu entfernen.
- Geben Sie entweder Ziegen-IgG-alkalische Phosphatase (AP), Fcγ-spezifisches Abs (für den IgG-Nachweis, 1:5.000 in PBS-T) oder Ziegen-Anti-Human-IgM-AP, Fcμ-fragmentspezifisches Abs (für den IgM-Nachweis, 1:5.000 in PBS-T) in die dafür vorgesehenen Vertiefungen und inkubieren Sie bei RT für 2 Stunden im Dunkeln.
- Waschen Sie jede Füllung zweimal mit 200 μl PBS, wie in Schritt 5.5.
- 50 μl/Vertiefung Bromchlorindolylphosphat-Nitroblau-Tetrazolium (BCIP/NBT)-Substratlösung zugeben. Lila gefärbte Flecken erscheinen in der Regel innerhalb von 5 - 15 Minuten.
- Fügen Sie 100 μl/Vertiefung ddH2O hinzu, um eine Überentwicklung von Flecken zu verhindern.
- Spülen Sie die Platten nach vollständiger Entwicklung aller Flecken mit fließendem Leitungswasser ab.
- Entfernen Sie den Unterabfluss der Platten und lassen Sie sie im Dunkeln an der Luft trocknen.
- Zählen Sie die Flecken mit einem automatischen Plattenleser mit einer Bildaufnahme-/Analyseeinheit (z. B. einem automatischen Scanner oder manuell über ein Präpariermikroskop).
Anmerkung: Die Platten können bei RT im Dunkeln gelagert und später analysiert werden.
