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Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Vorbereitung der Entnahmeröhrchen
- Stellen Sie die BMSC-Nährmedien her, indem Sie das Minimum Essential Medium α (MEM α) mit 10 % fötalem Kälberserum und 1 % Penicillin/Streptomycin ergänzen.
- Geben Sie 100 μl BMSC-Nährmedium in 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen. 3 Knochen passen normalerweise in ein einziges Röhrchen, also bereiten Sie sich entsprechend vor.
- Schneiden Sie die Enden von 200 μl Pipettenspitzen so weit ab, dass sie in die Zentrifugenröhrchen passen. Führen Sie die Spitzen in die Röhrchen ein und stellen Sie sicher, dass sich die Deckel schließen lassen, bevor Sie die Röhrchen auf Eis legen.
Anmerkung: Alternativ können 0,75 mL Mikrozentrifugenröhrchen mit abgeschnittenen Enden in das 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen eingesetzt werden.
>2. Entnahme von Knochen von Mäusen
- Die Tiere mit CO2 einschläfern, gefolgt von einer Gebärmutterhalsluxation und mit 70% Ethanol besprühen.
Anmerkung: Stellen Sie sicher, dass Tiere des gleichen Geschlechts und vorzugsweise des gleichen Alters verwendet werden. Wir verwenden routinemäßig Tiere im Alter von 7 bis 8 Wochen. Wir empfehlen, Zellen von mindestens 3 Tieren pro Versuchsgruppe zu poolen, um eine besser repräsentative und reproduzierbare Zellpopulation zu erhalten.
- Lege die euthanasierte Maus auf den Rücken auf ein Präparierbrett. Verwende eine Pinzette, um ein Zelt aus Haut auf dem Bauch zu erzeugen. Machen Sie einen kleinen Schnitt (ca. 1 cm) mit einer sterilen Präparierschere. Ziehen Sie die Haut zu den Gliedmaßen und den Füßen aus dem Schnitt zurück, um den Unterbauch und die Beine freizulegen.
- Unterhalb des Sprunggelenks schneiden, um den Fuß zu entfernen. Schneiden Sie entlang des Beckenkamms an der Hüfte, um den Oberschenkelkopf vom Hüftknochen zu trennen. Während die Maus noch auf dem Rücken liegt, machen Sie einen Schnitt in der Mitte des Hüftknochens, um die beiden Beckenknochen zu trennen.
- Entfernen Sie mit fusselfreien Tüchern vorsichtig den Muskel von den Oberschenkelknochen, den Tibias und den Beckenknochen.
Anmerkung: Wenn Sie so viel wie möglich von den Sehnen und Muskeln aus dem Knochen schneiden, wird die Reinigung mit den fusselfreien Tüchern (z. B. Kim-Tüchern) schneller und einfacher. Seien Sie vorsichtig, wenn Sie die Knochen manipulieren, da sie dazu neigen, leicht zu brechen und ihre Zerbrechlichkeit bei bestimmten Genotypen erhöht sein kann.
- Sobald alle Proben präpariert wurden, legen Sie sie in PBS auf Eis und bringen Sie sie für die restlichen Schritte der Isolierung in eine sterile Kulturhaube.
Anmerkung: Wenn so weit wie möglich aseptisch gearbeitet wird, wird das Kontaminationspotenzial in den Kulturen reduziert.
- Machen Sie kleine Schnitte (ca. 1 bis 2 mm) sowohl am proximalen als auch am distalen Ende der Knochen, bevor Sie sie in die geschnittenen Spitzen in den Zentrifugenröhrchen einsetzen.
Anmerkung: Stellen Sie sicher, dass eine ausreichende Menge geschnitten wird, damit das Knochenmark herausgeschleudert werden kann. Es muss jedoch darauf geachtet werden, dass nicht zu viel geschnitten wird, da die Zellpopulationen je nach Nähe innerhalb des Knochenmarkraums variieren.
- Bei 10.000 x g 15 s bei Raumtemperatur zentrifugieren. Stellen Sie sicher, dass das gesamte Knochenmark am Boden des 1,5-ml-Röhrchens gespült und pelletiert wird, während sich die Knochen in den Einsätzen befinden (entweder 200-μl-Pipettenspitze oder 0,75-ml-Mikrozentrifugenröhrchen). Sobald das gesamte Knochenmark gesammelt ist, entfernen Sie die Einsätze mit den Knochen aus den Entnahmeröhrchen.
Anmerkung: Wenn das gesamte Knochenmark gespült ist, erscheinen die Knochen weiß. Wenn jedoch Knochenmark in bestimmten Knochen verbleibt, versuchen Sie erneut, die Enden abzuschneiden und zu zentrifugieren.
>3. Zell-Suspension
- Ziehen Sie die Zellpellets mit einer 25-g-Nadel langsam auf und ab, um die Klumpen aufzubrechen, und kombinieren Sie alle Proben in einem einzigen konischen 15-ml-Röhrchen. Fügen Sie 10 ml BMSC-Nährmedien pro 500 μl Proben hinzu.
- Setzen Sie einen 70-μm-Filter auf ein konisches 50-ml-Röhrchen und leiten Sie die Zellsuspension durch diesen Filter, um mögliche Knochenfragmente zu entfernen.
>4. Plattierung und Kultur von gemischten Populationen von Knochenmarkzellen (Gesamt-BMCs)
HINWEIS: Die Zellen werden bei 37 °C in einem Inkubator mit 5% CO2 kultiviert.
- Berechnen Sie die Anzahl der Zellen und plattieren Sie sie mit 1,0 x 106 Zellen/cm 2 in Kulturmedien. Warten Sie 72 Stunden Mischkultur, bis sich die Zellen anheften.
Anmerkung: Wir empfehlen, die Zellsuspension 20x in Nährmedien zu verdünnen und erneut in Trypanblau zu verdünnen, bevor die Zellen mit einem Hämozytometer gezählt werden. Für 7 Wochen alte männliche C57Bl6/J-Mäuse liefern wir routinemäßig eine Zellzahl von etwa 50 x 106 Zellen, aber Alter, Geschlecht und Stamm können die Zellzahl stark beeinflussen.
Anmerkung: Eine gemischte Population von Zellen sollte sich am Boden der Kulturvertiefung anheften.
- Entfernen Sie nach 72 Stunden das Medium und ersetzen Sie es durch ein neues Medium. Wechseln Sie das Medium jeden zweiten Tag und prüfen Sie, ob es konfluenz. Wenn die Zellen eine Konfluenz von 80-100% erreichen, sind sie bereit für die Differenzierung.
Anmerkung: Da diese Kultur sowohl mit BMSCs als auch mit HSCs gemischt wird, kann sie direkt für die Osteoblastogenese, Adipogenese sowie Osteoklastogenese verwendet werden.
>5. Plattierung und Kultur der gespaltenen Population von BMSCs (Adhärente BMSCs)
HINWEIS: Die Zellen werden bei 37 °C in einem Inkubator mit 5% CO2 kultiviert.
- Alle Zellen, die aus den Femuren, Tibias und Beckenknochen einer Maus entnommen wurden, werden in eine 10 cm große Kulturschale (55 cm2 Kulturfläche) gegeben.
Anmerkung: Beim Pooling von 2-3 C57BL/6J-Mäusen legen wir diese "gesamte" Knochenmarkpopulation in der Regel in einen 150 cm2 Kolben.
- Entfernen Sie nach 48 Stunden Mischkultur den Nährboden (mit den nicht adhärenten HSCs). Wenn Osteoklastogenese-Experimente durchgeführt werden sollen, legen Sie diese Population von nicht adhärenten Zellen beiseite, wenn nicht, aspirieren Sie diese Zellen und verwerfen Sie sie.
- Die Platte/den Kolben vorsichtig mit PBS waschen, um die anhaftenden Zellen nicht zu stören.
- Entfernen Sie PBS und heben Sie die Zellen an, indem Sie 0,25 % Trypsin hinzufügen und 1-3 Minuten lang bei 37 °C inkubieren. Quenden Sie das Trypsin ab, indem Sie der Zellsuspension Zellmedien hinzufügen. Zu diesem Zeitpunkt können die BMSCs, die nun angehoben werden, gezählt werden (wie zuvor in Schritt 4.1 gemacht) und für zukünftige Experimente plattiert werden.
- Berechnen Sie die Anzahl der Zellen, die für die Beschichtung benötigt werden. Zentrifugieren Sie das erforderliche Volumen der Zellsuspension bei 1.000 x g für 5 min bei Raumtemperatur.
Anmerkung: Zellen werden in der Regel auf der Grundlage von Endpunktexperimenten plattiert. Wenn beispielsweise Protein/RNA isoliert werden soll, plattieren wir in der Regel mit einer höheren Dichte (~1,0-2,0 x 106 Zellen/Well in einer 6-Well-Platte).
- Entfernen Sie das Medium und resuspendieren Sie das Zellpellet in dem Volumen des Kulturmediums, das für die Beschichtung benötigt wird. Plattieren Sie die Zellen entsprechend den Experimenten mit Nährmedien und lassen Sie sie einige Tage lang anhaften. Wenn die BMSCs Konfluenz erreichen, fahren Sie mit der Differenzierung fort.
>6. Unterscheidung der BMSCs
- Adipozyten
- Stellen Sie Adipozyten-Basismedien her, indem Sie 90 ml Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) High Glucose, 10 mL fötales Rinderserum, 1 mL Penicillin/Streptomycin, 100 μl 20 mM Rosiglitazon und 100 μl 2 mM Insulin mischen. Lagern Sie dieses Medium bei Bedarf während des Differenzierungsexperiments eine Woche lang bei 4 °C.
- Stellen Sie Adipozyten-Induktionsmedien her, indem Sie 200 μl 62,5 mM 3-Isobutyl-1-methylxanthin (IBMX) und 25 μl 1 mM Dexamethason zu 25 mL Adipozyten-Basismedium hinzufügen.
- Sobald die BMSC-Kulturen (entweder die Gesamt-BMCs aus Schritt 4.3 oder die adhärenten BMSCs aus Schritt 5.6) konfluent sind, wechseln Sie das Medium zu einem Adipozyten-Induktionsmedium. Betrachten Sie diesen Tag 0 der Differenzierung.
- Entfernen Sie nach 48 Stunden das Medium und erfrischen Sie die Kultur mit Adipozyten-Induktionsmedien.
- Wechseln Sie an Tag 4 zu Adipozyten-Basismedien.
Anmerkung: Lipidtröpfchen können bereits am 2. oder 4. Tag auftreten.
- Beobachten Sie am 7. Tag, dass die Zellen ein Maximum an Lipidtröpfchen angesammelt haben und einen Phänotyp aufweisen, der einem reifen Adipozyten ähnelt. Kultivieren Sie nicht über diesen Punkt hinaus, da dies zum Zelltod/zur Zellablösung führen kann.