Flotationsbasierte T-Zell-Isolierung mittels Auftriebs-aktivierter Zellsortierung

Zusammenfassung

Quelle: Snow, T., et al. Flotationsbasierte T-Zellisolierung, -aktivierung und -expansion aus mononukleären Zellproben des menschlichen peripheren Blutes unter Verwendung von Mikroblasen. J. Vis. (2022)

Dieses Video zeigt die Isolierung von T-Zellen aus mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) unter Verwendung der funktionalisierten BACS-Technologie (Buoyancy-Activated Cell Sorting). Die Isolierungstechnik beinhaltet die positive Selektion von CD3+ T-Zellen, indem die Zellen mit biotinylierten Anti-CD3-Antikörpern markiert und die Antikörper-gebundenen Zellen mit Hilfe von Streptavidin-gebundenen Mikrobläschen getrennt werden.

Protokoll

>1. Isolierung von T-Zellen mit Mikrobläschen durch positive Selektion

HINWEIS: Dieses Protokoll beschreibt einen kleinen CD3⁺ positiven Selektionsansatz unter Verwendung von SAMBs.

1. Inkubieren Sie 3 x 10⁸ kommerziell hergestellte PBMC in 2,5 ml Trennpuffer mit biotinylierten Anti-CD3 (OKT3)-Antikörpern in einer Konzentration von 25 ng Antikörper pro 1 Million Zellen (25 ng/M). Mischen Sie vorsichtig, indem Sie auf und ab pipettieren, und inkubieren Sie es 10 Minuten lang bei Raumtemperatur.
2. Fügen Sie Streptavidin-Mikrobläschen (SAMBs) in einem Verhältnis von 0,5 (SAMB-Menge):1 (Zellmenge) entsprechend der vom Hersteller angegebenen SAMB-Konzentration hinzu.
3. Mischen Sie mit einem handelsüblichen End-over-End-Rotator (EOE) bei 20 U/min für 10-15 Minuten bei Raumtemperatur. 5 min bei 400 x g bei Raumtemperatur zentrifugieren.
4. Nach der Zentrifugation befinden sich die positiv ausgewählten Zellen an der Spitze der Suspension mit den SAMBs. Die verbleibenden nicht selektierten Zellen befinden sich im Zellpellet am Boden des Röhrchens. Führen Sie mit einer 9-Zoll-Glaspipette die Spitze unterhalb der Blasenzellenschicht in den Boden des Röhrchens ein, saugen Sie das Zellpellet und den Überstand mit einer elektronischen Pipette ab und übertragen Sie sie in ein neues Röhrchen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Biotin Anti-Human-CD3 (OKT3) Antikörper	Biolegende	Artikel-Nr.: 317320
Leukopak	BioIVT	HUMANLMX100-0001129
Normale humane PBMCs	BioIVT	HUMANHLPB-0002562
Streptavidin Microbubble Kit (enthält den Separationspuffer von Akadeum)	Akadeum	Tel.: 11110-000