Kultivierung von aktivierten T-Zellen aus mononukleären Zellen des menschlichen peripheren Blutes

Zusammenfassung

Quelle: Mølgaard, K., et al. Echtzeitüberwachung der mitochondrialen Atmung in Zytokin-differenzierten menschlichen primären T-Zellen. J. Vis. Exp. (2021).

In diesem Video beschreiben wir ein Protokoll für die Aktivierung menschlicher primärer T-Zellen. Die Inkubation naiver T-Zellen mit magnetischen Kügelchen, die mit Anti-CD3- und Anti-CD28-Antikörpern beschichtet sind, gefolgt von einer Interleukin-2- oder Interleukin-15-Behandlung, führt zur Aktivierung naiver T-Zellen und deren Differenzierung und Proliferation zu Effektor- oder Gedächtnis-T-Zellen.

Protokoll

Alle Eingriffe mit menschlichen Teilnehmern wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien für das Wohlergehen des Menschen durchgeführt und vom lokalen institutionellen Prüfungsausschuss überprüft.

>1. Kultivierung aktivierter humaner primärer T-Lymphozyten

1. Auftauen der Zellen (Tag 1)
   1. 10 mL RPMI 1640 pro Probe auf etwa 37 °C vorwärmen.
   2. Nehmen Sie die gewünschte Anzahl mononukleärer Zellampullen aus dem peripheren Blut und lagern Sie sie vorübergehend auf Trockeneis.
   3. Die gefrorenen Zellen werden in 10 ml vorgewärmtem RPMI 1640 resuspendiert.
   4. Zentrifugieren Sie die Zellen 5 min lang bei 500 x g bei RT.
   5. Der Überstand wird verworfen und die Zellen erneut gewaschen, indem RPMI 1640 in 10 ml resuspendiert und wie in Abschnitt 1.1.4 beschrieben zentrifugiert wird.
   6. Der Überstand wird verworfen und die Zellen bei 2 x 10⁶ Zellen pro ml X-VIVO 15 Medium + 5 % Humanserum (im Folgenden "T-Zell-Medium") resuspendiert.
   7. 2 ml der Zellen pro Well in eine 24-Well-Zellkulturplatte einfüllen und über Nacht bei 37 °C und 5 % CO₂ inkubieren.
2. Aktivierung der Zellen (Tag 0)
   1. Waschen Sie CD3/CD28-Kügelchen, indem Sie 12,5 μl Kügelchen pro 1 Million Zellen in ein Mikrozentrifugenröhrchen geben. Fügen Sie 12,5 μl PBS pro 12,5 μl Kügelchen hinzu.
      Anmerkung: Es ist wichtig, das Fläschchen mit den Kügelchen vor dem Gebrauch zu wirbeln.
   2. Legen Sie das Mikrozentrifugenröhrchen für 1 Minute auf einen geeigneten Magneten.
   3. Entsorgen Sie den Puffer und resuspendieren Sie die Kügelchen im ursprünglichen Volumen des T-Zell-Mediums (12,5 μl T-Zell-Medium pro 12,5 μl des ursprünglichen Volumens der Kügelchen).
   4. Fügen Sie 12,5 μl Kügelchen pro Million Zellen hinzu, was einem Verhältnis von 1:2 entspricht (Kügelchen: Zellen).
   5. Teilen Sie die Zellen in zwei Zustände mit jeweils etwa 5 Millionen Zellen auf.
   6. Fügen Sie das richtige Volumen an Zytokinen zu den in Tabelle 1 genannten Bedingungen hinzu.
   7. Inkubieren Sie die Zellen 3 Tage lang bei 37 °C und 5 % CO₂.
3. Kultivierung der Zellen (Tag 3 und 5)
   1. Resuspendieren Sie die Zellen und teilen Sie sie, indem Sie die Hälfte des Volumens aus jeder Vertiefung in eine neue Vertiefung übertragen. Geben Sie das gleiche Volumen frisches T-Zell-Medium in jede Vertiefung.
   2. Fügen Sie neue Zytokine zu jeder Bedingung hinzu, wie in Tabelle 1 erwähnt.

	Zytokin	Lager	Verdünnungsfaktor	Finale
Bedingung 1	IL-2	3 x 106 U/ml	30.000	100 U/ml
Bedingung 2	IL-15	2 x 105 U/ml	2.000	100 U/ml

Tabelle 1: Vorbereitung von Zytokinkulturen, die zur Steuerung von Stoffwechselveränderungen in T-Zellen verwendet werden.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
24-Well-Gewebekulturplatte	Nunc	142485
Anti-CD3xCD28-Kügelchen	Gibco	11161D
X-VIVO 15	Lonza	BE02-060F
Human-Serum	Sigma Aldrich	Nr. H4522	Hitze inaktiviert bei 56 °C für 30 min
IL-15	Peprotech	Nr. 200-02
IL-2	Peprotech	200-15
Lymphoprep	Stammzellen-Technologien	7801
Pbs	Thermo Fischer	10010023
RPMI 1640	Gibco-Thermo Fischer	61870036
T-Küvetten-Perlen Magnet DynaMag-2 Magnet	Thermo Fischer	12321D