Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Einzelzellisolierung aus PDLN
- Legen Sie ein steriles 250 μm Metallnetz über ein konisches 15-ml-Röhrchen in ein Rack. Spülen Sie das Netz mit 1 ml RPMI aus.
- Übertragen Sie die Lymphknoten in das Metallnetz und schleifen Sie sie mit einer Pinzette durch das Netz. Tragen Sie 1 ml RPMI auf das Metallnetz auf, um die Zellen in das Röhrchen zu spülen. Wiederholen Sie dies noch 3 Mal und entfernen Sie das Netz.
- Die Röhrchen bei 433 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Den Überstand entsorgen.
- Resuspendieren Sie das Zellpellet in ca. 5 ml RPMI. Füllen Sie die Röhrchen mit RPMI.
- Die Röhrchen bei 433 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Den Überstand entsorgen.
- Resuspendieren Sie das Zellpellet in ca. 5 ml RPMI. Füllen Sie die Röhrchen mit RPMI.
- Die Röhrchen bei 433 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Den Überstand entsorgen.
- Resuspendieren Sie das Zellpellet in 2 ml RPMI. 2 ml der Zellsuspension werden in 5 ml-Röhrchen mit rundem Boden und Zellsiebkappen überführt. Tragen Sie die Zellsuspension auf die Kappen des Zellsiebs auf.
>2. Durchflusszytometrie
- Die Zellsuspensionen aus PDLNs werden 5 min lang bei 4 ΰC bei 4 μg zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen.
- Färben Sie die Zellen mit folgenden Oberflächenantikörpern in 100 μl Durchflusszytometrie-Färbepuffer (FACS-Puffer): 0,75 μg/100 μl FITC-konjugierter CD4-Antikörper, 0,60 μg/100 μl APC-H7-konjugierter CD8-Antikörper, 0,30 μg/100 μl PE-konjugierter CD25-Antikörper, 5 μl (1: 20) APC-konjugierter Nrp1-Antikörper. Inkubieren Sie die Röhrchen 40 Minuten lang auf Eis.
- Geben Sie 200 μl FACS-Puffer in jedes Röhrchen. Die Röhrchen bei 433 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Den Überstand entsorgen. Wiederholen Sie dies noch einmal.
- Fixieren und permeabilisieren Sie die Zellen, indem Sie das Zellpellet in 500 μl Permeabilisierungsfixierungspuffer (PFB) resuspendieren.
Anmerkung: PFB wird hergestellt, indem 1 Teil Fixierungs-/Permeabilisierungskonzentrat mit 3 Teilen Fixierungs-/Permeabilisierungsverdünnungsmittel gemischt wird.
- Die Tuben über Nacht bei 4 °C im Kühlschrank aufbewahren.
Anmerkung: Eine 1-stündige Inkubation funktioniert auch.
- Die Röhrchen bei 433 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Den Überstand entsorgen.
- Resuspendieren Sie das Zellpellet in 500 μl Permeabilization Washing Buffer (PWB). Die Röhrchen bei 433 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Den Überstand entsorgen.
Anmerkung: PWB wird hergestellt, indem Permeabilisierungspuffer (10x) in destilliertem Wasser auf 1:10 verdünnt wird.
- Färben Sie die Zellen mit den folgenden intrazellulären Antikörpern in 100 μl PWB: 0,30 μg/100 μl PE-Cy7-konjugierter Foxp3-Antikörper, 4 μl (1: 25) PacificBlue-konjugierter Helios-Antikörper. Inkubieren Sie die Röhren 1 h lang auf Eis.
- Geben Sie 500 μl PWB in jedes Röhrchen. Die Röhrchen bei 433 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Den Überstand entsorgen.
- Resuspendieren Sie das Zellpellet in 500 μl PWB. Die Röhrchen bei 433 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Den Überstand entsorgen.
- Resuspendieren Sie das Zellpellet in 300 μl FACS-Puffer.
- Analysieren Sie die Zellen auf einem Durchflusszytometer.
- Gate für die einzelnen Zellen basierend auf "Seitlicher Streubereich", "Höhe und Breite" sowie "Vorwärts-Streubereich", "Höhe" und "Breite". Führen Sie eine Million Ereignisse zur Analyse aus.
- Exportieren Sie die FCS-Dateien der Experimente und analysieren Sie sie mit der Durchflusszytometrie-Analysesoftware.
