Isolierung von marginierenden hepatischen Leukozyten aus einer Mausleber

Zusammenfassung

Quelle: Sorski, L., et al. Selektive Entnahme von marginierenden-hepatischen Leukozyten. J. Vis. Exp. (2016)

In diesem Video demonstrieren wir die Isolierung von marginierenden Leberleukozyten aus der Mausleber durch erzwungene Perfusion.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

>1. Maus-Protokoll

1. Perfusion der Leber und Entnahme von MH-Leukozyten
   1. Euthanasieren Sie das Tier mit einer Überdosis von 8% Isofluran. Legen Sie vorsichtshalber ein 15-ml-Röhrchen mit einem mit Isofluran getränkten Pad um den Kopf der Maus, bis sich die Brusthöhle öffnet.
   2. Befestigen Sie die Gliedmaßen der Maus an einem Bett.
   3. Öffnen Sie die Bauch- und Brusthöhle, um die Leber und den Herz-Lungen-Komplex unmittelbar nach Beendigung der Atmung freizulegen, wobei der untere Aspekt des Zwerchfells intakt bleibt (um ein drainierendes Brusthöhlenbecken zu schaffen). Vermeiden Sie Blutungen durch diesen Prozess.
      1. Beginnen Sie den Schnitt insbesondere an der Mittellinie des unteren Bauches, ohne die inneren Organe zu beschädigen, und gehen Sie zu beiden Seiten diagonal zu den Rippen und schneiden Sie sie bis zur oberen Brusthöhle durch.
   4. Ziehe die Eingeweide heraus und platziere sie außerhalb des Tieres rechts vom Versuchsleiter, um die Pfortader freizulegen.
   5. Führen Sie eine 30 g Nadel, die mit einer Schlauchpumpe verbunden ist, in die Pfortader rostral zur Milzvene ein.
   6. Schneiden Sie die untere Hohlvene oberhalb des Zwerchfells, um die Drainage und Sammlung des Perfusats aus der Brusthöhle zu ermöglichen.
   7. Schalten Sie die Peristaltikpumpe mit einer Geschwindigkeit von ca. 3 ml/min ein und sammeln Sie vorsichtig die ersten 3 ml Perfusat, das mit Blut aus dem Brusthöhlenbecken kontaminiert ist.
   8. Entsorgen Sie dieses Perfusat. Wiederholen Sie eine solche Wäsche bei Bedarf erneut, indem Sie Kochsalzlösung verwenden, und beginnen Sie erst dann mit dem Sammeln von Leberperfusat.
   9. Initiieren Sie die Perfusion mit einer Geschwindigkeit von bis zu 4 ml/min und sammeln Sie 10 ml Perfusat aus der Brusthöhle mit einem Schmetterling, der mit einer Spritze verbunden ist.
   10. Beenden Sie die Durchblutung, wenn die Farbe der Leber hellbraun wird.

>2. Extraktion von Leukozyten

1. Zentrifugieren Sie das Perfusat für 10 min bei 400 x g.
2. Aspirieren Sie den Überstand.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Autoclud Schlauchpumpe
Schmetterlings-Nadel	OMG		26G
Schmetterlings-Nadel	OMG		21G * 3/4"
Spritze	Pic Lösung		1 ml
Spritze	Pic Lösung		2,5 ml
Spritze	Pic Lösung		5 ml
Spritze	Pic Lösung		ca. 10 ml
Spritze	Pic Lösung		25 ml
Zange mit abgestumpften Kanten
Schere
Gefäßklemme
Gewebezange