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Alle Eingriffe mit menschlichen Teilnehmern wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien für das Wohlergehen des Menschen durchgeführt und vom lokalen institutionellen Prüfungsausschuss überprüft.
>1. Differenzierung von Megakaryozyten
- 5 × 105 Zellen/ml CD34+ Zellen in 2 ml SFM ausfüllen, ergänzt mit 50 ng/ml rekombinantem humanem Thrombopoietin (rhTPO) pro Well in einer 12-Well-Platte. Die Zellen werden bei 37 °C und 5 % CO2 in einer befeuchteten Atmosphäre inkubiert. Wenn Zellen konfluent sind, bevor sie für die Analyse benötigt werden, ernten Sie die Zellen und teilen Sie sie mit frischem Medium und rhTPO in mehrere Vertiefungen auf.
Anmerkung: Zwei oder drei Vertiefungen sollten speziell vorbereitet werden, um die Differenzierung zu verschiedenen Zeitpunkten (z. B. Tag 7, 9 und 10) zu überwachen.
- Ernten Sie Zellen aus den Vertiefungen, die zur Überwachung der Differenzierung beiseite gelegt wurden, ohne die Zellen in den anderen Vertiefungen zu stören.
- Färbe Zellen mit 20 μl anti-GPIIb/CD41-FITC Antikörper und 10 μl anti-GPIX/CD42a-Alexa Fluor 647 Antikörper in einem Endvolumen von 100 μl ein. Richten Sie ein Kontrollröhrchen mit den jeweiligen Isotyp-Kontrollantikörpern ein. 15 - 30 min bei 4 °C inkubieren.
- Fügen Sie 1 ml SB zur Wäsche hinzu. Bei 400 × g 10 min zentrifugieren. Den Überstand verwerfen und das Pellet in 200 - 300 μl SB resuspendieren. Mittels Durchflusszytometrie analysieren.
- Analysieren Sie für jedes Fluorophor die Isotypkontrollen, um das Gating für FITC- und Alexa Flour 647-positive Populationen einzustellen. Analysieren Sie die gefärbten Zellproben, um den Prozentsatz der doppelt positiven CD41+/CD42a+-Zellen zu bestimmen, die eine reife MK darstellen (Abbildung 1C).
- Zur mikroskopischen Visualisierung von Zelloberflächenmarkern färben sich Zellen wie in 1.3 beschrieben.
- Fügen Sie 1 ml SB zur Wäsche hinzu. Bei 400 × g 10 min zentrifugieren. Das Pellet in 100 μl SB resuspendieren und 5 min bei 1.000 x g auf einen Objektträger schleudern. Fixieren Sie die Zellen auf dem Objektträger, indem Sie sie 30 s lang in Methanol tauchen. An der Luft trocknen, 20 μl Eindeckmedium mit DAPI zugeben (siehe Materialtabelle), mit einem Deckglas abdecken und mit einem Fluoreszenzmikroskop sichtbar machen (Abbildung 2A).
- Zur Visualisierung intrazellulärer Antigene resuspendieren Sie Zellen in PBS und fixieren Sie sie 15 Minuten lang bei Raumtemperatur mit Paraformaldehyd (1% Endkonzentration). Um die Zellen zu permeabilisieren, triton-X 100 (0,1%) zugeben und 15 Minuten inkubieren. Waschzellen mit 2 mL PBS/0,1 % Triton-X 100. In 100 μl PBS/0,1 % Triton-X 100 resuspendieren, Anti-vRf- und Anti-CD62p-Antikörper (1:200 Verdünnung) zugeben und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
- Mit 2 mL PBS/0,1 % Triton-X 100 waschen und 10 min bei 400 × g zentrifugieren, in 100 μl desselben Puffers resuspendieren und Anti-Maus-IgG-Alexa 594 und Anti-Kaninchen-IgG-Alexa 488 (1:100) hinzufügen. 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, mit 2 mL PBS/0,1 % Triton-X 100 waschen, in 100 μl desselben Puffers resuspendieren und 20 μl Anti-CD42b-APC zugeben. Schleudern Sie dann die Zellen auf Objektträger, wie in Schritt 1.6.1 beschrieben, und bereiten Sie die Proben für die mikroskopische Visualisierung vor, wie in Schritt 1.6.1 beschrieben.
- Für die Bestimmung der Ploidie ernten Sie die Zellen am 12. oder 13. Tag der Differenzierung. Fügen Sie 1 ml SB zur Wäsche hinzu. 10 min lang bei 400 × g zentrifugieren und mit 20 μl anti-GPIIb/CD41-FITC Antikörper in einem Endvolumen von 100 μl färben. 30 min bei 4 ΰC inkubieren.
- Einmal mit 1 ml SB waschen und das Pellet in 300 μl hypotonischem Citratpuffer (1,25 mM Natriumcitrat, 2,5 mM Natriumchlorid, 3,5 mM Dextrose) resuspendieren, der 20 μg/ml Propidiumiodid und 0,05 % Triton-X 100 enthält. 15 min bei 4 °C lichtgeschützt inkubieren.
- RNase bis zu einer Endkonzentration von 20 μg/ml zugeben und 30 min bei 4 °C lichtgeschützt inkubieren. Bestimmen Sie die Intensität von Propidiumiodid durch Durchflusszytometrie, indem Sie 30.000 bis 50.000 Ereignisse der CD41-FITC+-Population sammeln (Abbildung 2C).
>2. Prothrombozytenzählung, Thrombozytenzählung und Thrombozytenaktivierung
- Ernte von Zellen (aus Schritt 1.1) an den Tagen 8 oder 9 der Differenzierung und Aussaat an 1 × 104 Zellen/Well in 48-Well-Platten in 200 μl frischem SFM, ergänzt mit 50 ng/ml rhTPO. 5 Tage lang bei 37 °C, 5 % CO2,
Anmerkung: Zu Quantifizierungszwecken Saatgutvertiefungen in dreifacher Ausfertigung. Diese geringe Dichte ist für die Visualisierung und Zählung von proplättchentragenden MK erforderlich. Prothrombozyten beginnen in der Regel nach 2 Tagen Kultur zu erscheinen. Der Höhepunkt liegt zwischen Tag 4 und 5.
- Zählen Sie die Anzahl der proplättchentragenden MK in der gesamten Vertiefung an einem inversen Lichtmikroskop mit 10X- oder 20X-Objektiven.
Anmerkung: Ein beheizter (37 °C) Mikroskoptisch ist vorzuziehen, da das Halten der Zellen bei Raumtemperatur über einen längeren Zeitraum zu einer Schrumpfung der Thrombozytenfortsätze führt. Prothrombozyten werden als lange Fortsätze aus dem MK-Körper beobachtet. Jedes MK kann mehrere Thrombozytenvorsprünge aufweisen. Mit der Entwicklung von Blutplättchen nimmt der Körper des MK an Größe ab.
- Zellen ernten und bei 400 x g für 10 min bei Raumtemperatur zentrifugieren. Färben Sie Zellen mit 20 μl anti-humanem CD41-FITC-Antikörper, wie in den Schritten 1.3 und 1.4 beschrieben. Berechnen Sie den prozentualen Anteil an thrombozytenaggregationstragenden MK (pbMK):
pbMK (%) = [(Proplättchen-tragende MKs/ Vertiefung) / (CD41+-Zellen insgesamt/Vertiefung)] x 100
- Um die in das Kulturmedium freigesetzten Blutplättchen zu zählen, mischen Sie die Zellen vorsichtig mit einer Pasteurpipette und sammeln Sie 100 μl an den Tagen 14 oder 15 der Kultur.
- Mit 20 μL Anti-Human-CD41-FITC-Antikörper für 20 - 30 min bei 4 °C färben. Richten Sie ein Kontrollröhrchen mit dem jeweiligen Isotyp-Kontrollantikörper ein
.
- Fügen Sie 150 μl SB und 50 μl Zählperlen hinzu.
- Stellen Sie für die durchflusszytometrische Analyse FSC und SSC auf logarithmisches Skalieren ein. Verwenden Sie normale menschliche Blutplättchen aus plättchenreichem Plasma, das mit CD41-FITC gefärbt wurde, wie in Abschnitt 2.4.1 beschrieben, um das Gating für Thrombozyten einzustellen (Abbildung 3A).
- Analysieren Sie die gefärbten Blutplättchen, indem Sie die Kügelchen mittels Durchflusszytometrie zählen. Erfassen Sie 1.000 Ereignisse zum Zählen von Perlen mit dem Streudiagramm FSC versus SSC (Abbildung 3A). Berechnen Sie die Anzahl der Blutplättchen basierend auf CD41-FITC-positiven Ereignissen (Abbildung 3B) mit der Formel:
Thrombozyten pro μL=[(Anzahl der CD41-FITC-positiven Ereignisse)/1.000 Beads)] x [(Anzahl der Beads in 50 μL)/Probenvolumen)]
- Um die Thrombozytenaktivierung zu analysieren, mischen Sie die Zellen vorsichtig mit einer Pasteurpipette und sammeln Sie 100 μl an den Tagen 14 oder 15 der Kultur. Fügen Sie 1 mL Tyrode-Puffer (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1,8 mM CaCl2, 0,2 mM Na2, HPO4, 12 mM NaHCO3, 5,5 mM D-Glukose, pH 6,5) hinzu und zentrifugieren Sie bei 200 x g für 5 min die Pelletzellen.
- Den Überstand auffangen und 10 Minuten lang bei 800 x g zentrifugieren, um plättchengroße Partikel zu pelletieren.
- Den Überstand verwerfen und in 100 μl Tyrode-Puffer resuspendieren. 20 μl PAC1-FITC-Antikörper und Adenosindiphosphat (ADP) bis zu einer Endkonzentration von 20 μM zugeben. 20 min bei Raumtemperatur inkubieren. Analyse durch Durchflusszytometrie, um den Prozentsatz der FITC-positiven Ereignisse zu bestimmen. Es werden frische humane Blutplättchen verwendet, die auf die gleiche Weise wie eine Positivkontrolle behandelt wurden (Abbildung 3C).
