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Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. 3D Thymus-Organkultur zur Erzeugung von iTE
- Entnahme von fetalen Thymuslappen der Maus und Einsatz endogener Lymphozyten durch Behandlung mit Desoxyguanosin (dGUO).
- Nehmen Sie am 7. Tag der dGUO-Behandlung vier neue 10-cm-Schalen und füllen Sie sie mit jeweils 20 ml vollständigem Medium (Roswell Park Memorial Institute Media 1640 [RPMI 1640] + 10% FBS + 1x L-Alanyl-L-Glutamin + 1x Natriumpyruvat + 1x mindestens essentielles Medium mit nicht-essentiellen Aminosäuren (MEM-NEAA) + 1x Penicillin-Streptomycin + [1:1000] 2-Mercapto-Ethanol).
- Alle Nitrozellulosemembranen mit Thymuslappen in eine 10 cm große Schale geben. Lösen Sie die einzelnen Lappen mit einer Pinzette von der Membran und tauchen Sie sie in Medien ein. Entsorgen Sie die Membranen. 1 h bei RT inkubieren.
- Die Thymuslappen in eine neue 10-cm-Schale mit vollständigem Medium umfüllen und 1 h bei RT inkubieren. Diesen Schritt noch 2 Mal wiederholen.
- Befestigen Sie die Thymuslappen mit einer Pinzette an der Schale (einen nach dem anderen) und machen Sie mit der anderen Hand einen 100–200 μm tiefen Schnitt in der Mitte und verlängern Sie den halben Durchmesser des Lappens, um die Migration der T-Zell-Vorläuferzellen in den Lappen zu erleichtern.
- Übertragen Sie die Thymuslappen in eine neue 10-cm-Schale, die mit vollständigem Differenzierungsmedium gefüllt ist (vollständiges Medium + 5 ng/ml Maus-Interleukin-7 (IL-7) + 5 ng/ml Maus-Flt3-Ligand (FLT3L) + 5 ng/ml Stammzellfaktor (SCF)).
- Wenn Sie 3D-Kulturplatten mit unterem und oberem Gitter verwenden, füllen Sie optional beide Gitter mit sterilem PBS, um das Verdunsten und Austrocknen der hängenden Tropfen zu verhindern.
- Übertragen Sie 30 μl des vollständigen Mediums, das einen dGuo-behandelten Thymuslappen aus Schritt 1.6 enthält, in jede Vertiefung der 3D-Kulturplatte.
- Sammeln Sie nicht-adhärente Zellen der T-Linie (iPSC-abgeleitete unreife T-Zellen) aus OP9/DLL1-Co-Kultur (Tage 16-21) und resuspendieren Sie bei 2–5 x 10 3-T-Zellen pro 20-μl-Medium.
- Geben Sie 20 μl T-Linienzellsuspension in jeden Thymuslappen in der 3D-Kulturplatte. Über Nacht bei 37 °C mit 5 % CO2 inkubieren.
- Stellen Sie die P200-Pipette auf 30 μl ein und aspirieren Sie das Medium nach mehrmaligem Pipettieren aus jeder Vertiefung, um alle Zellen zu entfernen, die die Thymuslappen umgeben. Verwerfen Sie das Medium und fügen Sie 30 μl des vollständigen Mediums hinzu. Wiederholen Sie diesen Vorgang 5–7 Mal, um überschüssige unreife T-Zellen zu entfernen, die nicht in die Lappen wandern. Wechseln Sie danach täglich 25–30 μl des Mediums.
- Bestätigen Sie die Bildung eines Halos aus iPSC-abgeleiteten Thymus-Emigranten (iTE) um die Lappen ab den Tagen 4–5 durch Lichtmikroskopie.
- Sammeln Sie täglich iTE durch Pipettieren von Medien ohne Unterbrechung des Keulens. Wechseln Sie das Medium jeden Tag und setzen Sie die Erfassung bis zu ca. 12 Tage lang fort.
- Die geernteten iTE können für molekulare Analysen (Abbildung 1, Abbildung 2, Abbildung 3 und Abbildung 4) oder für In-vivo-Transplantationsexperimente verwendet werden.
