Alle Eingriffe mit menschlichen Teilnehmern wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien für das Wohlergehen des Menschen durchgeführt und vom lokalen institutionellen Prüfungsausschuss überprüft.
>1. Expansion von NK-Zellen aus Lebergewebe (Tag 0), wie in Abbildung 1 gezeigt.
HINWEIS: Die anfängliche Zellzahl und Lebensfähigkeit korrelieren stark mit der Zeit seit der Organentnahme und der anfänglichen Gewebeprobenmenge. Wenn das Gewebe jedoch in 30 mL Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) gelegt und über Nacht auf Eis oder im Kühlschrank bei 4 °C aufbewahrt wird, können NK-Zellen bis zu 24 h später immer noch in hoher Reinheit und Lebensfähigkeit expandiert werden.
- Identifizieren Sie lebensfähige Gewebebereiche, um Lymphozyten aus Geweben und Schnitten mit sterilen chirurgischen Geräten zu gewinnen.
- Legen Sie das Gewebe in 30 ml HBSS (ohne Kalzium oder Magnesium) und bewahren Sie es auf Eis auf, bis es bereit ist, sich auf die Isolierung vorzubereiten.
- Zerkleinern Sie das Gewebe mit sterilen Rasierklingen oder Scheren und Pinzetten in einer Biosicherheitswerkbank in <0,5 cm große Würfel.
- Bereiten Sie eine 1x Kollagenase IV Lösung (1 mg/ml) vor, indem Sie eine 10x Stamm in HBSS verdünnen (10x Kollagenase IV: 10 mg/ml oder ~200 U/ml).
- Legen Sie die zerkleinerten Gewebestücke in die Gewebedissoziatorröhrchen. Füllen Sie die Röhrchen mit nicht mehr als 4 g Gewebe und tauchen Sie die Gewebestücke in ~10 mL 1x Kollagenase IV.
Anmerkung: Die Verwendung von DNase I wird nicht empfohlen, da dies die Lebensfähigkeit und Ausbeute von NK leicht verringern kann. In der Materialtabelle finden Sie die verwendeten Gewebedissoziatorröhrchen.
- Legen Sie die Gewebedissoziatorröhrchen in einen Gewebedissoziator und mischen Sie sie bei 37 °C, um das Gewebe gründlich zu zerkleinern.
Anmerkung: Bei Lebergewebe kann dies über 30 Minuten dauern. Bei brüchigerem Gewebe können etwa 15 Minuten ausreichend sein. In der Materialtabelle finden Sie die spezifischen Gewebedissoziatorröhrchen und den verwendeten Gewebedissoziator.
- Entfernen Sie die Gewebedissoziatorröhrchen und zerreiben Sie sie mit der Rückseite einer 5-ml-Spritze durch ein 40-μm-Nylon-Zellsieb. Sammeln Sie das Eluent und entsorgen Sie die großen unverdauten Fragmente.
- Schleudern Sie das Eluent bei 400 x g für 5 min bei Raumtemperatur herunter. Aspirieren Sie den Überstand.
- Resuspendieren Sie die Zellpellets in 30 % Polyvinylpyrrolidon (PVP)-beschichteter Kieselsäure, um Fettzellen zu entfernen, die andernfalls die endgültige Lymphozytenfraktion kontaminieren würden.
- Zur Herstellung von 1x PVP-beschichteter Kieselsäure verwenden Sie eine 9:1-Verdünnung von PVP-beschichteter Kieselsäure in 10x PBS.
Anmerkung: In der Materialtabelle finden Sie die spezifisch verwendete PVP-beschichtete Kieselsäure.
- Zur Herstellung von 30 % PVP-beschichteter Kieselsäure wird 1x PVP-beschichtete Kieselsäure mit PBS/HBSS verdünnt.
- Schleudern Sie das Zellpellet bei 400 x g für 5 min bei Raumtemperatur herunter. Aspirieren Sie den Überstand.
- Resuspendieren Sie das Zellpellet in 9 mL R-10-Medien.
Anmerkung: Die Zusammensetzung von R-10-Medien finden Sie in der Materialtabelle
- Schichten Sie die Zellsuspension vorsichtig über 4 ml Ficoll oder Lymphozytentrennmedium, um Lymphozyten von roten Blutkörperchen und polymorphkernigen Zellen zu trennen.
- Trennen Sie die Schichten, indem Sie bei 400 x g für 23 min bei Raumtemperatur bei ausgeschalteter Beschleunigung und Bremse oder auf niedrigster Stufe zentrifugieren. Dekantieren Sie vorsichtig die obere mittlere Schicht und entnehmen Sie die Interphase mit gewebeinfiltrierenden Lymphozyten.
- Spülen Sie die Zellen mit 10 ml Medium und fahren Sie mit der Zellzählung, der Durchflusszytometrie, dem Aliquotieren und Einfrieren der Zellen oder dem primären NK-Expansionsprotokoll fort.
>2. Primäre NK-Zellexpansion aus PBMCs (oder CB- oder Organgeweben) (Tag 0), wie in Abbildung 2 gezeigt.
- Tauen Sie das gefrorene PBMC und die gefrorenen, bestrahlten Feederzellen in einem 37 °C heißen Wasserbad auf.
- Waschen Sie das PBMC und 100 gammabestrahlte (Gy-bestrahlte) 221-mIL-21-Zellen durch Zentrifugation bei 400 x g für 5 min mit 10 mL R-10-Medium separat.
- Sparen Sie 1 x 106 Zellen PBMC für die Durchflusszytometrie.
Anmerkung: Die anfängliche Reinheit der NK-Zellen ist ein wichtiger Faktor bei der Berechnung der Expansionsrate der NK-Zelle.
- Resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml R-10-Medien. Zählen Sie die Zellen mit Trypanblau.
- Mischen Sie 5 x 106 Zellen PBMC mit 10 x 106 Zellen mit 100 Gy-bestrahlten 221-mIL-21-Zellen in einer speziellen 6-Well-Platte (siehe Materialtabelle).
- Fügen Sie 30 ml R-10-Medien hinzu, die mit humanem IL-2 (200 U/ml) und humanem IL-15 (5 ng/ml) ergänzt werden (siehe Materialtabelle).
- Die spezielle 6-Well-Platte wird bei 37 °C mit 5 % CO2 inkubiert.
- Ersetzen Sie das Medium durch R-10-Medien, die mit humanem IL-2 (200 U/ml) und humanem IL-15 (5 ng/ml) ergänzt werden, um die NK-Zellen alle 3-4 Tage zu erhalten.
Anmerkung: Halten Sie weniger als 20 x 106 Zellen pro Vertiefung für eine weitere Expansion bei jedem Medienwechsel. Um die beste Lebensfähigkeit zu erzielen, stellen Sie sicher, dass die Gesamtzellzahl in jeder Vertiefung 100 x 106 Zellen nicht überschreitet.
- Erfassen Sie die Gesamtzahl der Zellen und die Viabilität und führen Sie alle 3-4 Tage eine Durchflusszytometrie durch, um die Expansionsrate der NK-Zellen zu berechnen.
