$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
>1. Vorbereitung von Objektträgern zur Adhäsion von Raji-Zellen
- Geben Sie 150 μl Fibronektin (100 μg/ml) pro Vertiefung in einen 8-Mikrotiter-Objektträger (Kunststoff-Bodenkammer-Objektträger) und inkubieren Sie ihn 30 Minuten bis 1 Stunde lang bei 37 °C. Dieses Adhäsionssubstrat ermöglicht die Bindung von Raji-Zellen an den Well-Boden (Schritt 2), die Bildung von lebenden Konjugaten mit Jurkat-Zellen (Schritt 4) und die Aufnahme von Zeitraffermikroskopie (Schritt 6) und ist auch nachträglich mit der optionalen Paraformaldehyd (PFA)-Fixierung kompatibel.
HINWEIS: Verwenden Sie für die Acetonfixierung Objektträger mit Glasbodenkammer und Poly-L-Lysin (20 μg/ml) anstelle von Fibronektin, da Aceton Kunststoff auflöst. Der Objektträger mit 8 Mikrotiterkammern (1 cm2 Well, 300 μl maximales Volumen) oder ein gleichwertiges Format ist ein flexibles und geeignetes Format.
- Aspirieren Sie Fibronektin mit einer automatischen 200-μl-Pipette und waschen Sie jede Vertiefung 2 Minuten lang mit 200 μl PBS unter leichtem Schütteln. Wiederholen Sie diese Wäsche noch einmal. Der Kammerobjektträger kann in diesem Stadium mit PBS 1-2 Wochen bei 4 °C gelagert werden.
>2. Adhäsion von Raji-Zellen an den Objektträgern der Kammer und Markierung von 7-Amino-4-chlormethylcumarin (CMAC)
- Übertragen Sie 10 ml einer konfluenten (1-2 x 106 Zellen/ml) Vorkultur von Raji-Zellen in ein 15 ml-Röhrchen mit V-Boden. Gut mischen und 10 μl verwenden, um die Zellen in der Neubauer-Kammer oder einer gleichwertigen Kammer zu zählen.
- Die restlichen Zellen bei 300 x g für 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren. Aspirieren Sie den Überstand und entsorgen Sie ihn.
- Resuspendieren Sie das Zellpellet vorsichtig in einem warmen vollständigen Kulturmedium (RPMI 1640 ergänzt mit 10 % FCS, 2 mM Glutamin, 10 mM HEPES, 100 U/mL Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin) in einer Konzentration von 106 Zellen/ml. Verwenden Sie die folgende Gleichung:
([ ]initial x Vinitial = [ ]final x Vfinal), wobei [ ]initial die anfängliche Zellkonzentration, Vinitial = das Anfangsvolumen der Zellsuspension, [ ]final = die endgültige Zellkonzentration, Vfinal = das endgültige Volumen der Zellsuspension darstellt.
HINWEIS: Abhängig von der Zellkonzentration der Ausgangskultur ist es möglich, mehr Zellen als nötig zu entnehmen, aber es ist wichtig, die verbleibenden Zellen bis zum Ende des Experiments in Kultur (37 °C) zu halten, um mögliche Probleme zu vermeiden (siehe Schritt 2.6).
- Markieren Sie Raji-Zellen, um ihre Identifizierung während der synaptischen Konjugatbildung zu ermöglichen. In diesem Experiment wird die Markierung von 7-Amino-4-chlormethylcumarin (CMAC) in Schritt 2.4.2 durchgeführt.
- Übertragen Sie die erforderliche Anzahl von Raji-Zellen im Kulturmedium in ein 2-ml-Röhrchen. Für die 8 Mikrotiterkammer-Objektträger werden insgesamt 1,6 mL der Zellsuspension benötigt (200 μL pro Well).
- Geben Sie CMAC in eine Endkonzentration von 10 μM. Halten Sie die Zellen im Dunkeln, indem Sie das Röhrchen mit Aluminiumfolie abdecken, da CMAC lichtempfindlich ist. 200 μL mit 2 x 105 Raji-Zellen werden pro 1 cm2 Vertiefung benötigt. Wenn also 8 Wells vorbereitet werden müssen, werden 1,6 x 106 Raji-Zellen benötigt.
HINWEIS: Die Markierung von Raji-Zellen mit Zelltracker-Blau (CMAC, UV-Anregung und blaue Emission) unterscheidet sie von Th-Zellen, wenn die synaptischen Konjugate gebildet werden. Dieser Farbstoff ist kompatibel mit PFA- und Aceton-Fixiermitteln und ermöglicht weitere Immunfluoreszenzverfahren. Versuchen Sie, Lichteinwirkung zu vermeiden. Die Markierung der Raji-Zellen in einem Pool mit CMAC mit anschließender Resuspension vor der Adhäsion der Raji-Zellen an die mit Fibronektin beschichteten Kammerobjektträger gewährleistet die homogene Markierung der Raji-Zellen mit CMAC zwischen verschiedenen Vertiefungen.
- CMAC-gefärbte Zellen werden resuspendiert und nach Aspiration des PBS in dem Kammerobjektträger aus Schritt 1.2 werden 200 μl der Zellsuspension in jede Vertiefung der mit Fibronektin beschichteten Kammerobjektträger übertragen, die in den Schritten 1.1 bis 1.2 hergestellt wurden. Inkubieren Sie den Kammerobjektträger bei 37 °C, 5 % CO2 für 30 min-1 h.
HINWEIS: Die Adhäsions- und CMAC-Beschriftung erfolgt in diesem Schritt gleichzeitig, was Zeit spart. Bitte beachten Sie, dass Raji-Zellen schnell sedimentieren und Vorsicht geboten ist, um vor der Aussaat eine homogene Konzentration in der Zellsuspension aufrechtzuerhalten. Es ist nicht notwendig, CMAC in diesem Stadium durch Zentrifugation zu waschen, da das Waschen von CMAC in Schritt 2.7 einfacher durchgeführt werden kann (wenn die markierten Raji-Zellen bereits an den Kammerobjektträgern haften). Da CMAC in der Zellsuspension in großem Überschuss vorhanden ist, ist der blaue Fluoreszenzhintergrund zu hoch, um die blau gefärbten Zellen zu unterscheiden. Überprüfen Sie die CMAC-Fluoreszenz der Zelle in Schritt 2.7 nach der CMAC-Wäsche.
- Stellen Sie sicher, dass die Raji-Zellen am Boden der Vertiefungen haften, indem Sie die Objektträger der Kammer am Mikroskop leicht schütteln. Stellen Sie sicher, dass die Zellen Lücken zueinander aufweisen und nicht zusammenfließen (Abbildung 1, mittleres Feld). 50-60% der Zellkonfluenz ist angemessen.
- Wenn die meisten Zellen effizient an dem Kammerobjektträger haften und keine Zelllücken beobachtet werden, waschen Sie jede Vertiefung mit einem warmen, vollständigen Medium und resuspendieren Sie das Medium mit einer automatischen 200-μl-Pipette, um den Zellüberschuss zu lösen. Überprüfen Sie die Konfluenz nach jedem Resuspensionsschritt.
- Wenn die Zellen nicht haften, wiederholen Sie den Adhäsionsschritt erneut und erhöhen Sie die Adhäsionszeit und/oder die Zellzahl.
HINWEIS: Es ist möglich, hier anzuhalten, den Kammerobjektträger über Nacht bei 37 °C, 5 % CO2 (O/N) zu inkubieren und am nächsten Tag mit dem Protokoll fortzufahren. Bitte bestätigen Sie am nächsten Tag, dass die Raji-Zellen adhäsiv und CMAC-markiert bleiben, indem Sie Fluoreszenzmikroskopie verwenden.
- Waschen Sie jede Vertiefung erneut sorgfältig mit warmem, zugesetztem RPMI, um überschüssige CMAC zu entfernen, und prüfen Sie mit dem Fluoreszenzmikroskop auf Blauemission (Abbildung 1).
HINWEIS: Um die Verwendung von Immersionsöl (klebrig und viskos) und Ölobjektiven mit hoher numerischer Apertur zu vermeiden, können Objektive mit extra langer Distanz (d. h. 20x oder 40x) verwendet werden, um die CMAC-Markierung mit dem Fluoreszenzmikroskop schnell zu überprüfen.
>3. Puls von CMAC — markierte Raji-Zellen mit Staphylokokken-Enterotoxin E
- Staphylokokken-Enterotoxin E (SEE, 1 μg/ml) in jede Vertiefung geben. SEE kann bequem in einem Zellkulturmedium (Arbeitslösung mit 100 μg/ml) aus den SEE-Tiefkühlbeständen (1 mg/ml in PBS) verdünnt werden. Verwenden Sie 2 μl der 100x Arbeitslösung pro 200 μl Mikrotiter.
ACHTUNG: Verwenden Sie für diesen Schritt Handschuhe und entsorgen Sie die gebrauchte Spitze in der Biohazard-Box.
- Inkubieren Sie den Objektträger der Kammer bei 37 °C, 5 % CO2 für mindestens 30 min. Die SEE-Wirkung hält mindestens 3-4 Stunden an.
HINWEIS: SEE kann bei Bedarf zu unterschiedlichen Zeitpunkten zu den Vertiefungen hinzugefügt werden, wenn unterschiedliche Zeitraffer-Setups geplant sind (Schritt 5) und/oder abhängig vom Startzeitpunkt für die Endpunkt-Experimente (Schritt 6).
>4. Vorbereitung von Jurkat-Zellen
- Für dieses Experiment wird eine zuvor gezüchtete Kultur von Jurkat-Zellen (1-2 x 106 Zellen/ml) verwendet. Verwenden Sie Zellen aus einem Standardkulturkolben oder aus einer früheren Transfektion nach Standard-Elektroporationsprotokollen, wie zuvor beschrieben. Die Transfektion von Jurkat-Zellen wird es ermöglichen, den Verkehr von sekretorischen Granulaten in lebenden Zellen im Zeitraffer sichtbar zu machen. Wenn z.B. GFP-CD63 (ein Marker für MVB) exprimiert wird, kann die Bewegung von GFP-CD63-dekorierten Vesikeln aufgezeichnet werden.
- Beobachten Sie die Zellen unter einem Phasenkontrastmikroskop. Wenn ein Überschuss an toten Zellen (>20-30%) beobachtet wird, führen Sie eine Ficoll-Dichtegradientenzentrifugation unter Verwendung von Standardprotokollen durch, um den Überschuss an toten Zellen (tote Zellen weisen eine höhere Dichte auf als lebende Zellen) vor der Verwendung (siehe Diskussion).
- Übertragen Sie die Zellen in ein 15-ml-Röhrchen mit V-Boden und verwenden Sie 10 μl für die Zählung mit einem Hämozytometer.
- Die restlichen Zellen werden wie in Schritt 2.2 beschrieben zentrifugiert. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in der gleichen Konzentration wie Raji-Zellen (1 x 106/ml) mit einem frischen, warmen Kulturmedium. Führen Sie die Schritte 2.2-2.3 aus.
- Bewahren Sie die Jurkat-Zellen in Kultur (37 °C, 5 % CO2) auf, während Sie auf Schritt 4.
HINWEIS: Bei der zweiten Option (Transfektion) wird die Anzahl der lebenden Zellen viel geringer sein als bei der ersten. Erwägen Sie daher, ein höheres Ausgangszellkulturvolumen zu verwenden, um genügend Zellen für das Experiment zu haben. Von 10 x 106 Jurkatzellen pro Elektroporationsküvette und Transfektion überleben nach 48 h Transfektion nur noch 2-4 x 106 Jurkat-Zellen und einige dieser Zellen gehen während des Ficoll-Schritts verloren. Somit ist in der Regel eine Elektroporationsküvette ausreichend, um die adhärenten SEE-gepulsten Raji-Zellen aus 8 Mikrowells zu provozieren (1,6 x 106 transfizierte Jurkat-Zellen erforderlich).
>5. Co-Seeding von Raji- und Jurkat-Zellen
- Nehmen Sie die Objektträger mit den CMAC-markierten, SEE-gepulsten, adhärenten Raji-Zellen aus dem Inkubator aus Schritt 3.2. Es ist nicht notwendig, den CMAC zu diesem Zeitpunkt zu waschen, da dies zuvor in Schritt 2.7 durchgeführt wurde.
- Aspirieren Sie das Kulturmedium jeder Vertiefung vorsichtig nacheinander aus einer Ecke der Vertiefung mit einer automatischen 200-μl-Pipette. Lassen Sie das Medium in der Vertiefung nicht vollständig austrocknen.
- Das Medium wird sofort durch 200 μl resuspendierte Jurkat-Zellen in Zellkulturmedium (1 x 106/ml) ersetzt, die in Schritt 4.5 hergestellt wurden. Wenn eine Zeitraffer-Bildgebung durchgeführt wird, fahren Sie unmittelbar nach diesem Schritt mit Schritt 6 fort, da Jurkat-Zellen dazu neigen, sehr schnell zu sedimentieren und synaptische Konjugate zu bilden. Der Einfachheit halber sollten die Mikrovertiefungen mit SEE-gepulsten, adhärenten Raji-Zellen, die in diesem Stadium keine Aussaat mit Jurkat-Zellen erhalten, bis zu einer späteren Provokation mit Jurkat-Zellen mit einem Zellkulturmedium aufbewahrt werden. Dies ermöglicht flexibel nachfolgende Herausforderungen mit Jurkat-Zellen für zusätzliche Zeitraffer- oder umgekehrtkinetische Endpunkt-Experimentansätze.
- Wenn ein Zeitraffer durchgeführt werden soll, fahren Sie schnell mit Schritt 6 fort. Dies beinhaltet die Co-Kultur für 1-2 Stunden auf dem Inkubator des Mikroskoptisches oder einem gleichwertigen Inkubator bei 37 °C, 5% CO2, um die synaptische Konjugatbildung und die gleichzeitige Bildaufnahme zu ermöglichen. Wenn eine Endpunktanalyse, aber kein Zeitraffer vorgesehen ist, überprüfen Sie die Konjugatbildung nach der Co-Kultur-Periode mit dem Mikroskop (wie in Abbildung 1), bevor Sie die Zellen fixieren.
>6. Zeitraffer-Bildgebung von entstehenden synaptischen Konjugaten
- Bereiten Sie das Mikroskop und die Inkubationskammer vor der Bildgebung vor. Für das Beispiel sind die detaillierten Mikroskopieeinstellungen in Abbildung 2.
dargestellt
HINWEIS: Wenn ein Zeitrafferexperiment geplant ist, sollten alle Mikroskopeinstellungen und Ergänzungen (Umgebungszellkulturkammer usw.) vorbereitet werden, bevor die Jurkat-Suspension zum Kammerobjektträger mit anhaftenden Raji-Zellen hinzugefügt wird. Die folgenden Schritte sind für ein kommerzielles Mikroskop beschrieben (Table of Materials). Es kann jedoch jedes inverse Fluoreszenzmikroskop verwendet werden, das mit einem Zellkultur-Inkubator ausgestattet ist.
- Verwenden Sie ein Mikroskop mit einer 60-fachen Ölimmersion und hoher numerischer Apertur, wenn Sie polarisierten Verkehr abbilden.
- Stellen Sie sicher, dass das automatische Fokussystem eingeschaltet ist, und stellen Sie den Versatz so ein, dass die an die Unterseite gebundenen Raji-Zellen fokussiert werden. Siehe Abbildung 1.
- Nachdem Jurkat zusätzlich zu jeder Vertiefung, die die adhärenten Raji-Zellen in Schritt 5.3 enthält, lokalisiert man den Objektträger der Mikrotiterkammer schnell auf dem vorgeheizten (1-2 h) Mikroskop-Tischinkubator (d.h. OKOlab) und wählt mit dem Mikroskop einige XY-Positionen aus, Felder, in denen es wahrscheinlich eine entstehende IS-Formation aufzeichnet, die beispielsweise durch eine Jurkat-transfizierte Zelle verursacht wird, die in den Mikroskopfokus fällt.
- Verwenden Sie einen vorgeheizten Mikroskoptisch-Inkubator, da beobachtet wurde, dass ein temperaturstabilisierter Tisch stabile X-, Y- und Z-Positionen beibehält. Kriterien für ein geeignetes XY-Feld sind: gut fokussierte und nicht konfluente Raji-Zellen (d.h. Lücken zwischen den Zellen aufweisend) und das Vorhandensein von transfizierten Jurkat-Zellen (dies kann durch die Kombination von Transmissions- und UV- oder GFP-Kanälen überprüft werden). Jurkat-Zellen sedimentieren sehr schnell (einige Minuten) auf dem Objektträger der Kammer, und die Chancen, entstehende Synapsen abzubilden, nehmen mit der Zeit ab (Abbildung 1). Es ist möglich, das Experiment entweder nach dem definierten Zeitraffer zu beenden oder mit Schritt 7 fortzufahren und die Konjugate für nachfolgende Immunfluoreszenz und Analysen zu fixieren.
HINWEIS: Es ist möglich, bis zu 16 verschiedene Mikroskopfelder aus bis zu 4 verschiedenen Mikrotiterbereichen für die gleichzeitige Zeitrafferaufnahme mit mehreren Vertiefungen mit der richtigen zeitlichen Auflösung (1-2 min pro Bild) auszuwählen. Die Einschränkung hängt sowohl von der Anzahl als auch von der Intensität (die sich auf die Kameraexposition auswirkt) der verschiedenen Fluorochrome ab, die abgebildet werden sollen (abhängig von der Anzahl der exprimierten fluoreszierenden Proteine, abgesehen von CMAC). Eine Möglichkeit, die Bildrate zu erhöhen, besteht darin, den CMAC-Kanal nur in einem von "n" Zeitrahmen für GFP aufzunehmen (d. h. n = 8, wie in Abbildung 2 gezeigt), da Raji-Zellen an den Well-Boden haften und sich nicht leicht wie Jurkat-Zellen bewegen lassen. Darüber hinaus kommt dies der Lebensfähigkeit der Zellen zugute, da häufige UV-Lichteinwirkung die Zellen schädigen kann. Versuchen Sie, die Zeitbildrate auf 1 Bild alle 1 Minute oder weniger einzustellen (d. h. 20 s pro Bild, Abbildung 2), da die Polarisation von MVB einige Minuten bis Stunden dauert. Für diese Mehrkanalerfassung ist ein Mikroskop erforderlich, das mit einem motorisierten Epi-Fluoreszenz-Revolver und entsprechenden Bandpass-Fluoreszenzfiltern oder Äquivalenten ausgestattet ist.
